新疆克拉玛依市某猪场不同生长期猪源大肠杆菌耐药性调查*

夏利宁，高 娟，苏战强，程伟华，帕力达·亚森

(新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)



新疆克拉玛依市某猪场不同生长期猪源大肠杆菌耐药性调查*

夏利宁，高 娟，苏战强，程伟华，帕力达·亚森

(新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

为调查新疆克拉玛依市某规模化猪场不同生长期猪源大肠杆菌对临床常用抗菌药物的耐药情况，从该猪场的 550 份粪样中分离出大肠杆菌 549 株，其中，哺乳猪源菌 200 株、妊娠猪源菌 100 株、保育猪源菌 100 株、育肥猪源菌 99 株和哺乳母猪源菌 50 株。试验采用微量肉汤稀释法测定不同生长期猪粪源大肠杆菌对 9 种临床常用抗菌药物的最小抑菌浓度。并通过卡方检验比较不同生长期猪粪源大肠杆菌耐药率的差异。结果发现，不同生长期的猪粪源大肠杆菌均对氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸两种抗菌药物高度耐药。其中，保育猪粪源大肠杆菌对安普霉素、恩诺沙星、阿莫西林/克拉维酸和头孢噻呋的耐药率显著高于其他生长期猪粪源大肠杆菌(P<0.05)，哺乳猪和保育猪粪源大肠杆菌耐药情况严重，对多种抗菌药物高度耐药，以 7 耐为主；育肥猪、哺乳母猪和妊娠猪粪源大肠杆菌以 3 耐为主。不同生长期的猪粪源大肠杆菌对临床常用抗菌药物的耐药程度不同。

不同生长期；大肠杆菌；耐药；最小抑菌浓度

大肠杆菌作为人和动物的肠道共栖菌和条件性致病菌，可以通过耐药质粒和耐药基因传递等多种方式将耐药性传播给人类，给食品安全和人类健康带来潜在危害[1]。随着抗菌药物在畜牧业中广泛使用，从人医临床、兽医临床以及环境分离的大肠杆菌存在耐药，且有逐年增加趋势[2]。此外，细菌多重耐药性问题也日趋严重[3]。新疆作为全国畜牧业生产基地，近几年畜牧业发展迅速，本研究通过对克拉玛依某规模化养猪场临床分离的不同生长期猪源大肠杆菌进行耐药性调查和分析，以掌握该地区不同生长期猪源大肠杆菌的耐药情况，为该养殖场大肠杆菌病的防制和临床用药的风险评估提供科学依据，并为该地区今后养殖业合理有效地使用抗菌药提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

2013年3月在新疆克拉玛依市某规模化猪场采集样品。以健康猪为采集对象，通过肛拭子在其直肠采集新鲜粪样共550份。分离试验用大肠杆菌549株，采样背景见表1。大肠杆菌标准质控菌为ATCC25922(杭州天和微生物试剂有限公司)。

1.2 培养基

本研究所采用的麦康凯培养基和Mueller-Hinton(MH)培养基均采购自北京奥博星生物技术有限公司。

1.3 试验药品

喹诺酮类：环丙沙星(含量为100%)、诺氟沙星(含量为99.6%)和恩诺沙星(含量为100%)；β-内酰胺类：头孢噻呋(含量为100%)、氨苄西林(含量为86.5%)和阿莫西林(含量为86.6%)/克拉维酸(含量为100%)；氨基糖苷类：庆大霉素(含量为99.5%)、安普霉素(含量为55.8%)和阿米卡星(含量为65.5%)；上述药品均为标准品，采购自中国兽药监察所。

1.4 试验方法

1.4.1 药物敏感性试验 按美国临床实验室标准委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的微量肉汤稀释法。具体操作如下：按照倍比稀释法，将抗菌药物原液用MH肉汤稀释成10个梯度，依次用8道排枪将其移入96孔细胞培养板前10列孔中，每孔100 μL。用MH肉汤将测试菌株稀释成105CFU/mL，用移液枪由低浓度到高浓度在每排的前10孔依次加入稀释菌液100 μL。每排的第11孔加100 μL对应的稀释菌液作阳性对照，每排的第12孔加100 μL灭菌肉汤作阴性对照。35～37 ℃培养18～24 h，观察各孔培养液中细菌的生长情况，以抑制细菌生长的药物最低浓度作为测试药物的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MICs)。对试验用大肠杆菌针对上述药物每株菌做2个平行，以ATCC25922菌株作为标准质控。质控菌对 9 种抗菌药物的 MICs 均在质控范围内，且阳性对照肉汤长菌，阴性对照肉汤清亮，则MICs 结果真实可信，结果判定参照美国临床实验室标准委员会CLSI标准[4-5]。

表1 不同生长期的猪源大肠杆菌来源

1.4.2 统计分析 不同生长期猪源大肠杆菌耐药率差异性分析采用SPSS 20.0软件进行卡方检验。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离鉴定

除育肥猪粪样的大肠杆菌分离率为99.0%外，其余生长期猪粪样的大肠杆菌分离率皆为100.0%。采样数及分离率详见表 1。

2.2 不同生长期猪粪源大肠杆菌耐药结果及耐药差异性分析

不同生长期的猪粪源大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药情况的耐药结果见表2，由表2可以看出，分离的猪粪源大肠杆菌对氨苄西林的耐药率较高，其中，保育猪粪源大肠杆菌对氨苄西林的耐药率最高，占92.0%(92 株)，其次是妊娠猪粪源大肠杆菌和哺乳猪粪源大肠杆菌，分别占84.0%(84 株)和83.4%(167 株)，再次是育肥猪粪源大肠杆菌和哺乳母猪粪源大肠杆菌，耐药率分别为82.8%(82 株)、82.0%(41 株)；除氨苄西林外，不同生长期的猪粪源大肠杆菌对阿莫西林/克拉维酸和庆大霉素的耐药也较严重，耐药率分别为保育猪粪源大肠杆菌91.0%(91 株)和79.0%(79 株)，育肥猪粪源大肠杆菌83.8%(83 株)和51.5%(51 株)，妊娠猪粪源大肠杆菌81.0%(81 株)和60.0%(60 株)，哺乳猪粪源大肠杆菌64.0%(128 株)、75.5%(151 株)，哺乳母猪粪源大肠杆菌52.0%(26 株)、62.0%(62株)。此外，哺乳猪和保育猪粪源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物也表现出高度耐药，特别是保育猪粪源大肠杆菌，对恩诺沙星和诺氟沙星耐药率分别为79.0%(79 株)和63.0%(63 株)。

此外，从表2可知，保育猪粪源大肠杆菌对安普霉素(56.0%)、恩诺沙星(63.0%)、阿莫西林/克拉维酸(91.0%)和头孢噻呋(41.0%)的耐药率显著高于其他生长期猪粪源大肠杆菌(P<0.05)；而哺乳猪粪源大肠杆菌对诺氟沙星(53.5%)、庆大霉素(75.5%)和恩诺沙星(67.0%)的耐药率也显著高于其他生长期(除保育猪外)猪粪源大肠杆菌(P<0.05)；与此同时，育肥猪粪源大肠杆菌对阿莫西林/克拉维酸(83.8%)的耐药率显著高于哺乳母猪和妊娠猪(P<0.05)；而哺乳母猪粪源大肠杆菌对环比沙星(40.0%)的耐药率显著高于其他生长期(除哺乳猪外)猪粪源大肠杆菌(P<0.05)。

2.3 不同生长期猪粪源大肠杆菌多重耐药结果比较

由表3可知，不同生长期的猪粪源大肠杆菌的多药耐药结果存在差异，其中，妊娠猪粪源大肠杆菌以 3 耐(26.0%，26 株)为主，其次为 2 耐(13.0%，13株)和 5 耐(13.0%，13 株)，再次是 6 耐(12.0%，12 株)和 4 耐(10.0%，10 株)；哺乳猪粪源大肠杆菌以 7 耐(18.0%，36 株)为主，其次为 3 耐(15.5%，31 株)，再次为 6 耐(15.0%，30株)和 4 耐(11.5%，23 株)；保育猪粪源大肠杆菌以7耐(29.0%，29 株)和6耐(21.0%，21株)为主，其次为 5 耐(12.0%，12 株)、3 耐(11.0%，11 株)和 4 耐(8.0%，8株)；哺乳母猪粪源大肠杆菌以 3 耐(18.0%，9株)和5耐(18.0%，9株)为主，其次0耐、2耐和6耐皆为(14.0%，7株)；育肥猪粪源大肠杆菌以3耐(23.2%，23株)为主，其次是2耐(22.2%，22株)和4耐(20.2%，20株)。

表2 不同生长期耐药差异性分析结果

注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标记表示差异不显著(P>0.05)。

Note: Data in the same row with lowercase superscripts were significantly different (P<0.05), those with the same or no superscripts indicates insignificant difference (P>0.05).

表3 不同生长期多药耐药差异性结果

3 讨 论

分离的不同生长期猪源大肠杆菌对临床常用的 3 大类 9 种抗菌药物呈现不同程度的耐药，且有各自的耐药特点。以阿莫西林为例，保育猪源大肠杆菌耐药率达91.0%，而哺乳母猪源大肠杆菌则不到60.0%。此外，哺乳猪粪源大肠杆菌株对诺氟沙星、恩诺沙星和安普霉素的耐药率略高于其他生长期的猪源菌株，而保育猪粪源大肠杆菌对安普霉素、恩诺沙星、阿莫西林/克拉维酸和头孢噻呋的耐药率显著高于其他生长期猪粪源大肠杆菌(P<0.05),这可能与饲料中添加治疗剂量的抗菌药物用于疾病的防制有密切关系[6]，提示应加强哺乳猪粪源大肠杆菌和保育猪粪源大肠杆菌的耐药性监测。不同生长期的猪粪源大肠杆菌对上述常用抗菌药物的多药耐药结果也有所差异，妊娠猪粪源大肠杆菌和育肥猪粪源大肠杆菌都以 3 耐为主；哺乳母猪粪源大肠杆菌则以 3 耐和 5 耐为主；哺乳猪粪源大肠杆菌和保育猪粪源大肠杆菌多重耐药情况较为严重，以 7 耐为主，猜测可能与用药习惯有关，如长期使用某种药物防治疾病，不注意间隔或轮换其它药物，则易致使病原菌产生耐药。

张秀杰等[7]对 2011 年包头地区细菌进行耐药性监测，发现猪源大肠杆菌对环丙沙星的耐药率达到72.1%，对庆大霉素耐药率为62.7%。Jiang等[8]2011 年对592 株猪源和禽源大肠杆菌耐药性试验显示，耐药性最高氨苄西林耐药率可达99.5%，阿莫西林为65.1%。朱玲琦等[9]对2009-2012 年上海地区某医院喹诺酮类药物耐药分析，结果表明大肠杆菌对左氧氟沙星的耐药率大于67%。曹小利等[10]2012 年对多地区三甲医院取样研究发现大肠杆菌对环丙沙星的耐药率为78.5%。阮祥春等[11]2013 年从安徽省部分地区多个猪场分离的大肠杆菌，经过耐药性监测，发现该地区猪源大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林耐药菌高达70%以上，对恩诺沙星、氟苯尼考的耐药菌株在30%以上，而对阿米卡星高度敏感。王汝都等[12]2013 年对周口地区猪致病性大肠杆菌耐药性监测，结果表明菌株中对阿莫西林的耐药率达90.2%，对恩诺沙星的耐药率为75.6%、对环丙沙星的耐药率为59.5%，耐药率高于本试验结果。

不同地区大肠杆菌耐药性存在差异是因各地区流行菌株不同导致其用药不同。大肠杆菌对抗菌药物产生耐药性的直接后果，是严重影响临床疗效，增加治疗成本，同时缩短新药应用周期，增大新药研究与开发成本[13]。同一耐药类型菌株有着相似的耐药谱型，可能是由于细菌处于相同的药物选择压力下，从而导致相似耐药谱型的出现，或在大肠杆菌中存在耐药性的相互传递[6]。而抗菌药物的不合理使用，加快了细菌耐药性的发展，使得耐药性成为抗菌药在兽医临床应用中的一个严重问题。为了减少或延缓耐药性的产生，在用药的过程中应严格掌握适应症，交换使用不同种类或不同作用机制的药物或联合用药[14]。

4 结 论

综上所述，该猪场不同生长期猪粪源大肠杆菌对氨苄西林、庆大霉素和阿莫西林/克拉维酸抗菌药物耐药情况严重，在临床治疗细菌性疾病时，应停用该类药物，更换其他抗菌药物作为治疗药物。不同生长期猪粪源大肠杆菌的多药耐药结果也不同，以 3 耐和 7 耐最常见，提示养殖厂应树立合理使用抗菌药物的用药理念。

[1] 刘玉芹,陈翠珍,杨彩然,等. 冀东地区猪源大肠杆菌分离株的耐药性调查[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2012(12):111-112.

[2] 刘小强. 宠物源大肠杆菌对付喹诺酮类药物的多药耐药机制的研究[D]. 陕西杨凌：西北农林科技大学,2012.

[3] 张秀英, 王磊杰, 徐国锋,等.哈尔滨地区猪源多重耐药大肠杆菌接合性质粒和整合子检测[J]. 东北农业大学学报, 2013，44(9):40-45.

[4] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twentieth Informational Supplement[S]. CLSI document M100-S22. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute，2012.

[5] [CLSI]Clinical and Laboratory Standards Institute, Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals; Approved Standard-Fourth Edition[S]. CLSI document VET01-A4. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2013.

[6] 贺丹丹, 黄良宗, 陈孝杰,等. 不同动物源大肠杆菌的耐药性调查[J]. 中国畜牧兽医, 2013,40(10):211-215.

[7] 张秀杰, 高慧灵, 姜采荣,等. 2011年包头地区细菌耐药性监测[J]. 中国药房, 2013,3(6):3 206-3 208.

[8] Jiang H X, Lü DH, Chen Z L, et al. High prevalence and widespread distribution of multi-resistant Escherichia coli isolates in pigs and poultry in China[J]. The Veterinary Journal，2011，187(1):99-103.

[9] 朱玲琦, 许丽雯. 2009-2011年上海中医药大学附属龙华医院住院患者氟喹诺酮类药应用情况及耐药分析[J]. 中国医院用药评价与分析, 2012,12(7):601-604.

[10] 曹小利, 郑 波, 李 耘, 等. 质粒介导的喹诺酮耐药基因在中国大陆尿液分离的大肠埃希菌中的广泛分布[J]. 中国临床药理学杂志, 2012,28(2):103-106.

[11] 阮祥春, 曾明华, 黄媛媛, 等. 安徽省部分地区致病性大肠杆菌耐药性分析[J]. 安徽农业大学学报, 2013,40(3):430-433.

[12] 王汝都, 郑爱荣. 周口地区猪致病性大肠杆菌血清型调查及耐药性监测[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2013(3):105-107.

[13] 张秀英, 王磊杰, 徐国锋, 等. 哈尔滨地区猪源多重耐药大肠杆菌接合性质粒和整合子检测[J]. 东北农业大学学报, 2013,44(9):44-45.

[14] 罗 颖, 曾以萍. 临床抗菌药物滥用现状分析及对策研究[J], 华西医学, 2013,28(7):1 127-1 131.

Survey on Tolerance ofEscherichiacoliIsolates from Swines at Different Growth Stages in Xinjiang

XIA Li-ning, GAO Juan, SU Zhan-qiang, CHENG Wei-hua, PALIDA Ya-sen

(CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

To investigate the tolerance ofE.coliisolates of swines at different growth stages in a pig farm in Karamay, Xinjiang, 549E.coliwere separated from 550 fecal samples, including 200E.colifrom the sucking piglets, 100 from nursery pigs, 100 from pregnant pigs, 99 from fattening pigs and 50 from lactating sows. Resistant rate ofE.colifrom pigs at different growth stages to nine kinds antibacterial drugs were determined by the broth micro-dilution method, chi square test to compare the difference.The results showed thatE.coliisolates from pigs at the different growth stages were highly resistant to ampicillin and amoxicillin / clavulanic acid. Among them, the resistance rate ofE.colito apramycin, enrofloxacin, amoxicillin / clavulanic acid and ceftiofur from nursery pigs was significantly higher than the resistance rate ofE.colifrom pigs at other growth periods (P<0.05),E.coliisolates from the lactating pigs and nursery pigs were highly resistant to 7 kinds of antimicrobial drugs.E.coliisolates from fattening pigs, lactating sows; pregnant pigs were resistant to 3 kinds of antimicrobial drugs. Resistance rate ofE.coliisolates to antimicrobial drugs were different at various growth periods.

different growth stages;E.coli; resistance; minimum inhibitory concentration

2014-11-19

2015-01-20 [基金项目] 国家自然科学基金项目(31260614)

夏利宁(1975-)，女，湖南人，副教授，博士，硕士生导师，研究方向为兽医药理与毒理学。E-mail：xln750530@163.com

S811.6

A

1005-5228(2015)09-0069-04