菌种发酵歧化甘油产1,3-PDO条件研究*

刘汝宽， 陈金良， 肖志红， 李昌珠

(1.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004；2.中南大学 化学与化工学院, 湖南 长沙 410083；3.湖南省生物柴油工程技术研究中心，湖南 长沙 410004)

菌种发酵歧化甘油产1,3-PDO条件研究*

刘汝宽1, 2*， 陈金良1, 3， 肖志红1, 3， 李昌珠1, 3

(1.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004；2.中南大学 化学与化工学院, 湖南 长沙 410083；3.湖南省生物柴油工程技术研究中心，湖南 长沙 410004)

以甘油为原料，通过单因素实验对菌株间歇发酵法生产1,3-丙二醇的生产条件进行了研究.结果表明：最适的甘油含量为40 g/L，最适氮源为(NH4)2HPO4，用量为3 g/L，pH 7.5，温度为30 ℃，装液量为40%，摇床转速为100 r/min，发酵时间为24 h.在最佳培养基组成与最佳发酵条件下发酵了3批，最终的1,3-PDO浓度平均值为23.2 g/L，甘油的摩尔转化率为70.2%，比优化前的60.5%提高了9.7%.

1,3-丙二醇；发酵；优化；甘油

1,3-丙二醇(1,3-PDO)是一种重要的化工原料，可用于防冻剂，也是多种增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料.但最主要的用途是作为单体与对二甲酸合成新型聚酯材料——聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)，它具有良好的回弹性、易染性、抗污性、耐磨性、低吸水性及生物可降解性.随着全球对PTT需求量的日益增高，对关键原料1,3-丙二醇的需求量也逐渐加大.

目前，1,3-丙二醇的生产方法有化学方法和微生物发酵法.大规模应用于工业化生产的主要是化学合成法，国际市场主要由壳牌(Shell)和杜邦(Du Pont)公司垄断，但从其生产技术的发展趋势来看，正在由相对成熟的化学合成法向微生物发酵法过渡[1～5].其主要原因是：化学方法资源不可再生，且环境污染严重，使其长久发展受到限制；而微生物发酵法生产1,3-丙二醇具有原材料来源广泛、环境污染小、资源可再生等优点，并能适应可持续发展的需要[6].

微生物发酵法生产1,3-丙二醇关键是菌种及发酵条件，本实验以优选的克雷伯氏肺炎杆菌2e为发酵菌种，对培养基及发酵条件进行优化，通过对甘油浓度、氮源种类及用量、发酵的PH值、温度、转速等单因素试验，优化了培养基配比及发酵工艺条件.

1 材料及方法

1.1 试验材料

菌种是本实验室分离出的克雷伯氏肺炎杆菌2e，所用培养基组成见参考文献[7].所用仪器有HZS-HA水浴振荡器(哈尔滨市东明医疗仪器厂)，1 mL移液枪(Eppendorf)，常见玻璃仪器，GC-2014气相色谱仪(岛津).

1.2 分析方法

1.2.1 生物量分析 采用比浊法测定波长650 nm下细胞的光密度(OD650)[8].细胞干重测量：取10 mL发酵液离心(10 000 r/min)15 min后用去离子水洗涤2次，在80 ℃下干燥至恒重.

1.2.2 测定1,3-PDO的含量 采用气相色谱法测定1,3-PDO的含量，选取1,6-己二醇作为内标物，色谱柱长30 m,柱直径0.25 mm,液膜厚度0.25 μL，进样室250 ℃,检测器240 ℃；程序升温：110 ℃,4 min，5 ℃/min升温到120 ℃，再以30 ℃/min升温190 ℃,1.7 min；载气线速度12 mL/min，进样量0.4 μL.

1.2.3 甘油含量的测定 甘油剩余量分析参考文献[9].计算公式如下：

式中： 92.1 为甘油分子量；C为标准NaOH溶液浓度(mol/L)；V为滴定过程中消耗掉的标准NaOH溶液的体积(mL)；n为吸取的发酵液量(mL).

2 结果与讨论

2.1 甘油用量影响

保持基础培养基其他成分和浓度不变，改变培养基的甘油用量为10、20、30、40、50、60、70、80、90 g/L，接种，pH 7.2；于30 ℃、150 r/min摇床培养24 h，测OD650值，甘油剩余量及1,3-PDO含量，结果见图1.

由图1可知，随着甘油浓度的增大甘油的剩余量迅速增大，而1,3-PDO产量则是先上升后下降，甘油为40 g/L时1,3-PDO产量最大，并且甘油的剩余量也很低，这时甘油的利用率达到了最大值.低浓度时细菌生长比较好，但甘油主要用来提供细菌生长，而没有转化成1,3-PDO；而高浓度的甘油抑制了细菌的生长，故1,3-PDO产量很低.因此选择40 g/L甘油作为最佳初始甘油浓度.

2.2 氮源种类的影响

保持基础培养基其他成分和浓度不变，选取甘油含量为40 g/L，改变培养基的氮源的种类为(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、NH4H2PO4、NH4NO3、蛋白胨和酵母膏，含量均为2 g/L，接种，pH 7.2；于30 ℃，150 r/min摇床培养24 h，测OD650值，甘油剩余量及1,3-PDO含量结果见图2.

由图2可知，不同种类的氮源对2e菌的生长量和1,3-PDO产量的影响很大，其中以NH4NO3为氮源时，菌株的生长量最小，1,3-PDO产量几乎为零；以(NH4)2HPO4为氮源时，菌株的生长量和1,3-PDO产量均达到最大，甘油的剩余量也达到最小值.因此选择(NH4)2HPO4为最佳氮源进行后续研究.

2.3 (NH4)2HPO4用量的影响

保持基础培养基其他成分和浓度不变，选取甘油含量为40 g/L，(NH4)2HPO4用量为1、2、3、4 g/L.接种，pH 7.2；于30 ℃，150 r/min摇床培养24 h，测OD650值，甘油剩余量及1,3-PDO含量结果见图3.

由图3可知，加入(NH4)2HPO4后，菌体生长很迅速，培养24 h后OD650值都在2.1以上；随着量的增加，1,3-PDO的产量经历了先增加后减少，3 g/L时达到最大值.由甘油的剩余量曲线图可知，它与1,3-PDO产量曲线图正好成互补状态.即1,3-PDO产量高的，甘油消耗就多；反之甘油剩余量就多.

2.4 发酵条件

2.4.1 pH值的影响 保持基础培养基其他成分和浓度不变，选取甘油含量为40 g/L，(NH4)2HPO4用量3 g/L，依次改变发酵液的初始pH 为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5.接种后于30 ℃,150 r/min摇床培养24 h，测OD650值，甘油剩余量及1,3-PDO含量,结果见图4.

由OD650值曲线可知弱酸性条件不利于2e菌的生长，并且此菌利用甘油产丙二醇的能力比较低；而中性或弱碱性条件则是此菌的有利生长环境，1,3-PDO的产量较高，在pH为7.5时OD值达到峰值，此时1,3-PDO产量也最高，甘油剩余量较少.因此选择7.5为最佳pH值条件进行后续工作的研究.

2.4.2 温度的影响 温度既能影响反应速率和发酵液的物理性质，也能改变代谢产物的合成方向，是发酵培养的重要条件.保持基础培养基其他成分和浓度不变，选取甘油含量为40 g/L，(NH4)2HPO4用量3 g/L，依次改变发酵液的初始pH接种后于150 r/min摇床培养24 h，测OD650值，甘油剩余量及1,3-PDO含量，结果见图5.

由图5可知，温度由24 ℃升温到26 ℃时，菌的生长量和1,3-PDO产量都有明显升高的趋势，再升温到30 ℃，二者的变化速率降低，但是仍然在升高，30 ℃都达到最大值，温度再升高，两者迅速降低，这表明温度对细菌的生长和1,3-PDO产量有比较大的影响，高温不利于菌生长产1,3-PDO.从甘油剩余量曲线可以看出，在26 ℃以下32 ℃以上甘油剩余量都很大，32 ℃时剩余量最小，此温度下甘油的利用率最大.综合考虑，选择30 ℃作为最佳培养温度进行后续的研究工作.

2.4.3 通气量的影响 通气量是考察细菌对氧的需求情况，虽已鉴定是兼氧性细菌，但仍需进一步探讨.因此在上述优化条件基础上，选择100 mL的三角瓶，分别装入20、30、40、50、60、70 mL发酵液，密封后于150 r/min摇床培养24 h，测OD650值，甘油剩余量及1,3-PDO含量,结果见图6.

该菌在好氧条件下(装液量少)生长得比较快，但是丙二醇的产量不高.此时的甘油利用率比较高，原因可能是好氧条件下菌生长旺盛，消耗的甘油主要用来繁殖而没有产1,3-PDO.在通气量小的条件下生长缓慢，产丙二醇的效率也很低，原因是没有足够多的菌来工作产1,3-PDO.由图6可以看出在100 mL的三角瓶中装入发酵液40 mL条件下甘油的利用率最高，丙二醇的产量最大，因此选择装液量为40%为最佳通气量.

2.4.4 摇床转速的影响 利用前面的优化结果，选择摇床转速分别为50、75、100、125、150、175、200 r/min考察转速对菌体生长情况、甘油剩余量及1,3-PDO生成量的影响，结果如图7所示.

由图7可以看出，50 r/min菌体没有充分生长，1,3-PDO产量也很低，原因菌体生长只能在局部消耗营养物质，转速达到100 r/min，菌体生长量和产量都迅速增加而基本达到最大值，此时甘油剩余量也比较小.再增加转速，1,3-PDO产量基本不再提高，甘油剩余量也没有太大的变化.因此从节能和1,3-PDO产量两方面综合考虑，选择100 r/min作为最佳转速进行后续的研究工作.

2.5 发酵时间优化

发酵时间的长短关系到菌种发酵1,3-PDO的效率，时间越短，效率越高，单位时间内产1,3-PDO的量就大，有利于实现工业化生产.选择12、24、36、48、60、72、84、96 h进行发酵，其结果见图8.

由图8可以看出，培养12 h菌体没能充分生长，12～24 h菌迅速生长，24 h以后生长量不再升高，随着时间的延长反而有下降的趋势，原因可能是发酵液中的甘油含量有限，到发酵后期不能提供足够的营养.发酵24 h后1,3-PDO产量基本上达到了最大值，延长时间其产量并没有增加太多，但是甘油的剩余量有所下降，原因是菌体代谢消耗甘油.因此，发酵时间选择24 h为宜，这样既能提高1,3-PDO产量，又能提高生产效率.

3 结 论

通过对菌体发酵的最适培养基组成、最优发酵条件以及最佳发酵时间的单因素实验的研究，得到了最适的甘油含量为40 g/L，最适氮源为(NH4)2HPO4，用量为3 g/L；通过单因素试验优化的最优发酵工艺条件为pH 7.5,温度为30 ℃,装液量为40%,100 r/min,最佳发酵时间为24 h.在最佳培养基组成与最佳发酵条件下，发酵菌种3批，最终的1,3-PDO浓度平均值为23.2 g/L，甘油的摩尔转化率为70.2%，比优化前的60.5%提高了9.7%.

[1] DECKWER W D. Microbial conversion of glycerol to 1 ,3-propandiol [J] . FEMS Microbiology Reviews, 1995,16 :143-149.

[2] ZENG A P, BIEBL H. Bulk chemicals from biotechnology : The case of 1 ,3-propanediol production and the new trends [J] . Adv Biochem Eng/Biotechnol ,2002,74: 239-259.

[3] E I Du Pont de Nemours and Company. Production of 1 ,3-propanediol from glycerol by recombinant bacteria expressing recombinant diol dehy-dratase :US,5821092[P] . 1998-10-13.

[4] Henkel Kommanditgesell schaft auf Aktien , Gesellschaft fuer Biotechnol-ogische Forschung mbH. Fermentive production of 1 ,3-propanediol: US,5254467[P] . 1993-10-19.

[5] 修志龙. 微生物发酵法生产1 ,3-丙二醇的研究进展[J] .微生物学通报, 2000, 27(4) : 300-302.

[6] 谢家明，徐泽辉，夏蓉晕，等. 1,3-丙二醇制备工艺的研究进展[J].合成纤维, 2005, 2; 15-18.

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[8] 刘海军，张代佳，徐友海，等. 微生物发酵法中试生产1,3-丙二醇[J]. 现代化工, 2007, 27(20); 56-58.

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责任编辑：朱美香

Conditions of Disproportionation Fermentation of Glycerol for 1,3-Propanediol by Bacteria

LIURu-kuan1,2*,CHENJin-liang1,3,XIAOZhi-hong1,3,LIChang-zhu1,3

(1.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004;2.College of Chemistry & Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083;3.Hunan Engineering Center for Biodiesel, Changsha 410004, China)

Through single-factor test, conditions of disproportionation fermentation by glycerol for 1,3-propanediol (PDO) by bacteria were optimized. The results show that the optimal glycerol content is 40 g/L, the optimum nitrogen source is (NH4)2HPO4with dosage of 3 g/L, pH of 7.5, temperature of 30 ℃, liquid volume of 40%, shaking speed of 100 r/min, and fermentation time of 24 h. In the optimal medium and fermentation conditions, three batches of experiments were carried out and the average concentration of 1,3-PDO could reach 23.2 g/L, which raised the molar yield of glycerol from 60.5% to 70.2%.

1, 3-propanediol; fermentation; disproportionation reaction; glycerol

2014-07-16

国家林业局公益项目(201304608)；湖南省科技计划项目(2013NK3059)

刘汝宽(1981— ),男，山东 腾州人，副研究员.E-mail:liurukuan@gmail.com

TQ923

A

1000-5900(2015)01-0062-05