赤狐耳成纤维细胞的体外培养及核型分析

鲍加荣，王世勇，郑军军，杨福合*

(1.中国农业科学院 特产研究所，吉林 长春 130112;2.特种动物分子生物学省部共建国家重点实验室，吉林 长春130112)

狐属于食肉目犬科动物，是重要的毛皮动物，是裘皮产业的三大支柱之一［1］。人工饲养的主要有赤狐(Vulpesvulpes)、银黑狐(Vulpesvulpes)和蓝狐(Alopexlagous)，银黑狐是赤狐(图1)在自然条件下的毛色体变种，都是狐属毛皮动物，蓝狐则属于北极狐属。我国饲养的狐毛绒品质和国外有一定的差距，毛皮品质亟待提高。此外，从国外引进的种狐在国内饲养后，也出现品质下降。主要原因是我国养殖户不注重种狐的选育，养殖的狐容易发生近交，从而导致毛皮品质下降。另外，引进的种狐因为其饲养条件的改变也会出现毛皮品质下降。因此，培育适合当地饲养环境的狐是毛皮动物养殖业的重大需求。近年来，在动物的育种和品种改良中，体细胞克隆是一种重要的繁育技术［2］。体细胞克隆是将动物的体细胞作为核供体，注入另一个去核的成熟的卵细胞中，体外培养、诱导至一定发育时期，再移植到特定雌性生殖系统中，着床发育成新的个体［3］。1997年，第一头克隆羊“Dolly”利用这项技术诞生后［4］，动物的体细胞克隆迅速发展，这项技术能加快动物新品种的培育。体细胞也是一种动物遗传资源的保存材料，成为特种动物资源保存的一种补充。但体细胞的来源也是一个重要的问题，从卵丘等部位采集供体细胞，对动物伤害较大，而动物的耳皮肤成纤维细胞是理想的供体，是一个取材简便、拥有完整遗传信息、细胞活性良好的体细胞来源［5］。迄今为止，已成功获得了牛［6］、羊［7］和猪［8］等动物的耳成纤维细胞，特种动物狐的耳成纤维细胞还未见报道。本实验从赤狐耳组织活体采样，建立耳成纤维细胞体外培养体系，使得优异个体遗传资源得以长期保存下来，为狐资源的保存和利用提供技术支持。同时，也为狐的体细胞克隆及狐的发育生物学研究提供很好的研究素材。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

本实验采集狐耳边缘组织(0.2 cm×1 cm)，将毛刮净，用75%酒精消毒片刻，再用含有青－链霉素的PBS缓冲液冲洗3～5遍。将组织放入含有抗生素的DMEM培养基中带回实验室。

DMEM(Gibco，含谷氨酰胺)，FBS(Gibco)，青—链霉素(Gibco)，秋水仙素(Sigma)。

1.2 方法

1.2.1 成纤维细胞原代培养 用眼科剪和手术刀去掉毛和软骨，再将狐耳组织剪成0.1 cm×0.1 cm的小块，将小组织块均匀分布于培养瓶底，加入少量培养液(DMEM+10%FBS)，润湿底部，组织块间距约0.5 cm。将培养瓶倒置放入37℃，5%CO2培养箱中培养，4～6 h后翻转，加入少量培养液。1 d后，补加适量培养液，再培养3～4 d换液。直到有成纤维细胞游离出即可拣出组织块，加入培养液继续培养。

1.2.2 狐耳成纤维细胞传代培养当原代成纤维细胞汇合至80%～90%时，吸出培养基，加入0.25%胰蛋白酶进行短暂消化(约1～3 min)，以可见少量细胞被消化为宜，收集消化液，1 000 g离心5 min，根据细胞数量进行传代培养。在后续的培养过程中，视细胞生长情况进行换液并进行短时消化，再传代。一般经过3次纯化培养后，基本可得到较纯的成纤维细胞。

1.2.3 狐耳成纤维细胞的冷冻保存及复苏 取第4代生长中的成纤维细胞，加入0.25%胰蛋白酶进行消化，收集细胞，1 000 g，离心5 min。加入提前配好细胞冻存液:DMEM+20%FBS+10%DMSO，使细胞密度达到106/mL，分装于无菌冻存管中，置于程序降温盒，或经过4℃ 30～60 min;－20℃ 2～4 h，放入－80℃过夜，最后放入液氮中长期保存。一月后，取出一管冻存的成纤维细胞，迅速放入37℃水浴锅中，要在30 min内全部溶解。溶解后，将细胞放入加有完全培养基(DMEM+10%FBS)的培养瓶中培养。24 h后更换培养基，以消除DMSO对细胞的影响。

1.2.4 狐耳成纤维细胞染色体标本制作 取第6代成纤维细胞进行传代，待生长到指数期时加入秋水仙素，终浓度为0.1 μg/mL，继续培养4 h，用0.25%胰蛋白酶消化，1 000 g离心5 min收集成纤维细胞。按照以下程序进行染色体制备:0.068 mol/L的KCl溶液低渗20 min后，加入固定液(V甲醇∶V乙醇=3∶1)1 mL预固定，离心弃上清;加入固定液5 mL重复固定3次，每次15 min;最后用少量固定液制成细胞悬液，滴2～3滴细胞悬液于预冷的载玻片上，空气干燥。Giemsa染色、水洗、干燥，用显微镜观察照相。

1.2.5 狐耳成纤维细胞染色体核型分析及数据处理 在显微镜下，选取分散状态良好的染色体分裂相进行照相，测定染色体臂长，并根据染色体臂长数据计算臂比值，从而对染色体进行配对和分类。

计算公式如下:臂比=长臂长度(q)/短臂长度(p)

图2 成纤维细胞的原代培养Fig.2 Primary culture of fibroblasts

图3 成纤维细胞的纯化培养Fig.3 Pure culture of fibroblasts

图4 成纤维细胞复苏Fig.4 Resuscitaion culture of fibroblasts

2 结果分析

2.1 成纤维细胞

2.1.1 成纤维的原代培养 耳组织块经剪碎，置培养瓶中培养，成纤维细胞逐渐游离出来，形成单个成纤维细胞，成纤维细胞呈梭状，见图2。

2.1.2 成纤维细胞的纯化培养 原代培养的成纤维细胞经短时消化后，收集消化液再进行培养。一般经过3次培养后可得较纯净的成纤维细胞，如图3。

2.1.3 成纤维细胞的冻存复苏 冻存后的成纤维细胞进行复苏培养，培养3～4 d即可长满整个培养瓶，显示冻存复苏的成纤维细胞具有良好活性，见图4。

2.2 赤狐染色体核型分析

根据Robinson［9］所制定的人类染色体标准，依臂指数将染色体分为中央着丝粒染色体(1.0～1.7)，亚中央着丝粒染色体(1.7～3.0)，亚端部着丝粒染色体(3.0 ～7.0)，端部着丝粒染色体(大于7.0)。

经过统计计算分析，染色体臂比及分类数据见表1。赤狐染色体数为2n=32+X，Y，按形态可以分为17对，前16对(编号1～16)为常染色体，其中第1～12为中央着丝粒染色体(M)，第13～16为亚中央着丝粒染色体(SM)。第17对为性染色体，在公狐为XY，且X为中着丝粒(M)染色体，Y染色体为亚中央着丝粒(SM)染色体，见图5。

表1 染色体臂比值和染色体分类Tab.1 Arm ratio and classification ofchromosomes

图5 赤狐染色体核型分析Fig.5 The karyotype of red fox

图6 微小染色体(箭头所示)Fig.6 Microchromosomes(The arrows showed)

3 讨论

耳缘组织取材方便，对动物伤害小，成为各种动物的成纤维细胞的重要来源，为相关的研究提供了良好的素材。成纤维细胞对胰酶消化敏感，因此采用胰酶短暂消化法消化成纤维细胞，经过3～6次纯化培养即可得到较纯的成纤维细胞。

染色体分析时常用的遗传变异分析方法，简单易行且不需要精密仪器，故本论文也采用了此方法对狐染色体进行了分析。这是一个经典的实验操作，但是要获得好的分裂相则需要注意一些技术细节。如秋水仙素浓度太低，染色体则细长，分裂中期的细胞数少;反之容易使染色体聚缩过度，染色体的长度不够，影响分析。低渗步骤中要注意用量和时间，低渗液量过多或低渗时间过长，都可导致细胞破裂而失去大量的染色体，低渗液量过少或低渗时间过短，染色体舒展不开，容易堆积，不利于后期观察分析，所以摸索出合适的用量和固定时间［10］。载玻片的处理也很重要，玻片有油污、不干净会影响细胞和染色体的分散，制作染色体标本时要选择洁净无油、无杂质的载玻片。另外，玻片冷却也是影响核型分析的重要因素，玻片应在使用前置于－20℃冷却2 h以上。此外，还要注意细胞液的浓度和滴片的高度，还有培养液中小牛血清的质量和比例等因素。

在狐核型制作和分析时，发现有微小染色体(图6)。狐属动物中存在微小染色体［11］，又称B染色体，这是在长期的进化过程中发生的。它不同于常染色体，其形态非常小，但携带有功能基因，如Graphodatsky等［12］通过FISH技术发现C-Kit存在于B染色体上，其遗传机制与生物性状的关系尚不明白。C-kit基因是影响毛色形成和变异的重要基因［13-14］。狐属动物的微小染色体与狐性状特征之间的联系有待进一步研究。

本研究中对常染色体分类与前人的研究基本相同，但对Y染色体的分类与前人的研究结果不同，李军祥等［15］将Y染色体法归为中央着丝粒染色体，Graphodatsky等［11，16］将Y归为端着丝粒染色体。本研究表明，Y染色体其臂比值为1.833，应将其归为亚中央染色体。产生不同结果的原因可能动物的产地不同，不同地区的狐染色体形态发生了形态变异。

［1］郭永佳.狐的品种［J］.特种经济动植物，2003，7(1):2.

［2］Lee S，Park E J，Moon J H，et al.Sequential treatment with resveratrol-trolox improves development of porcine embryos derived from parthenogenetic activation and somatic cell nuclear transfer［J］.Theriogenology，2015，84(1):145-198.

［3］Choi Y H，Velez i C，Macias-Garcia B，et al.Timing factors affecting blastocyst development in equine somatic cell nuclear transfer［J］.Cellular Reprogramming，2015，17(2):124-153.

［4］Wilmut I，Schnieke A E，Mcwhir J，et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells［J］.Nature，1997，385(6619):810-812.

［5］Fernandes I R，Russo F B，Pignatari G C，et al.Fibroblast sources:Where can we get them?［J/OL］.Cytotechnology，2014:1-6［2015-04-01］.http://link.spring er.com/artide/10.1007%2 fs/0616 －014 －9771 －7.

［6］Zakhartchenko V，Alberio R，Stojkovic M，et al.Adult cloning in cattle:potential of nuclei from a permanent cell line and from primary cultures［J］.Mol Reprod Dev，1999，54(3):264-335.

［7］Liu C Q，Guo Y，Guan W J，et al.Establishment and characterization of a fibroblast cell line derived from Mongolian sheep［J］.Animal Science Journal，2011，82(2):215-222.

［8］Harrison S，Boquest A，Grupen C，et al.An efficient method for producing alpha(1，3)-galactosyltransferase gene knockout pigs［J］.Cloning and Stem Cells，2004，6(4):327-357.

［9］Robinson A.A proposed standard system of nomenclature of human mitotic chromosomes［J］.JAMA:the Journal of the American Medical Association，1960，174:159-220.

［10］Martin F.Meiotic instability of Pythium sylvaticum as demonstrated by inheritance of nuclear markers and karyotype analysis［J］.Genetics，1995，139(3):1233-1278.

［11］Graphodatsky A S，Beklemisheva V R，Dolf G.High-resolution GTG-banding patterns of dog and silver fox chromosomes:description and comparative analysis［J］.Cytogenet Cell Genet，1995，69(3/4):226-256.

［12］Graphodatsky A S，Kukekova A V，Yudkin D V，et al.The proto-oncogene C-KIT maps to canid B-chromosomes［J］.Chromosome Res，2005，13(2):113-134.

［13］Hachiya A，Sriwiriyanont P，KOBAYASHI T，et al.Stem cell factor-KIT signalling plays a pivotal role in regulating pigmentation in mammalian hair［J］.J Pathol，2009，218(1):30-38.

［14］Yan S Q，Hou J N，Bai C Y，et al.A base substitution in the donor site of intron 12 of KIT gene is responsible for the dominant white coat colour of blue fox(Alopex lagopus)［J］.Animal Genetics，2014，45(2):293-298.

［15］李军祥.银黑狐染色体的核型［J］.黑龙江畜牧兽医，2000(5):34.

［16］A M.The standard karyotype of the silver fox(Vulpes fulvus Desm.)［J］.Hereditas，1985，103:171-176.