硫酸阿托品注射液两种含量测定方法的比较

黄海燕，唐佳莉

（1南通市药品检验所，江苏226002；2无锡卫生高等职业技术学校）

硫酸阿托品是抗胆碱类药物，主要用于胃肠道、胆绞痛，散瞳检查验光，角膜炎，有机磷农药中毒、感染性休克等综合征的治疗，效果显著，安全性高，临床应用广泛。硫酸阿托品注射液原定中国药典（2010年版）方法采用酸性染料比色法（紫外分光光度法，UV法），由于操作过程复杂步骤较多，试验干扰因素多，对操作人员及技术要求高，故导致UV法结果重复性、准确性下降，故本文建立了高效液相色谱法（HPLC法）测定硫酸阿托品注射液的含量[1-2]，并对两种方法的测定结果进行了比较，结果证明HPLC法准确可靠，操作简便。为科学制定硫酸阿托品注射液的含量测定方法提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Varian cary100紫外可见分光光度计；戴安Ultimate 3000四元泵高效液相色谱仪；METTLER TOLEDO CPA225D电子天平；METTLER TOLEDO 320 pH计。

1.2 试药 硫酸阿托品对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100040-201011，含量：96.5%）；硫酸阿托品注射液（河南天方药业股份有限公司,规格：1mL：0.5mg；天津药业集团新郑股份有限公司，规格：1mL：0.5mg）；乙腈为色谱纯（Merck公司）；水为超纯水（超纯水机：Milli-Q Academic）；磷酸二氢钾、磷酸、氢氧化钠均为分析纯。

2 方 法

2.1 高效液相色谱法（HPLC法）[1-2]

2.1.1 色谱条件：色谱柱：Agilent C18（150mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：0.03mol·L-1磷酸二氢钾溶液－乙腈（80∶20）（用磷酸或氢氧化钠试液调节pH 值至 5.0）；柱温：30℃；检测波长：225nm；流速：1.0mL·min-1；进样量：20μL。

2.1.2 样品的制备：（1）对照品溶液：精密称取硫酸阿托品对照品10.49mg，置200mL量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为对照品溶液。（2）供试品溶液：精密称取硫酸阿托品注射液5mL置50mL量瓶中，加水稀释刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.3 专属性考察：按硫酸阿托品注射液处方（氯化钠0.9g加注射用水100mL溶解）模拟空白，按上述方法进行测定，得到不含主药的辅料液相色谱图，与对照品溶液和供试品溶液的色谱图进行对比。结果见图1，表明辅料在检测波长225nm处对含量测定无干扰。

图1 HPLC色谱图

2.1.4 线性范围考察：精密称取硫酸阿托品对照品适量，加水溶解并稀释成含硫酸阿托品0.004861，0.009722，0.01944，0.04861，0.009722，0.19445，0.38890mg·mL-1的溶液，取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度（mg·mL-1）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得回归方程：Y=2.7850+4859.1X（r=0.9999），表明硫酸阿托品在（0.004861～0.38890）mg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 定量限：取对照溶液逐步稀释配成系列溶液进行分析，按峰高为基线噪声的10倍（S/N）计算，最低检出量为0.4861ng。

2.1.6 重复性试验：取天津药业集团新郑股份有限公司，批号1404171供试品，按上述方法进行操作，平行测定6次，记录色谱图，按外标法计算含量，得平均含量为97.8%，计算得RSD=0.14%，表明本方法重复性良好，符合检测要求。

2.1.7 精密度试验：精密量取浓度为0.04861 mg·mL-1硫酸阿托品对照品溶液20μL，连续进样6次，结果硫酸阿托品峰面积RSD为0.58%（n=6），表明仪器精密度好。

2.1.8 稳定性试验：配制供试品溶液，分别于0，2，4，8，12h，24h 量取 20μL，注入液相色谱仪，记录硫酸阿托品峰面积，计算得峰面积的RSD=0.02%（n=6），结果表明供试品溶液经24h放置，基本稳定。

2.1.9 回收率试验：按制剂处方配制空白辅料，称取9份处方量的空白辅料，分别置50mL量瓶中，按低（80%），中（100%），高（120%）3个水平配制供试品溶液，各3份，照上述测定方法进行测定，并计算回收率。结果表明，硫酸阿托品的平均回收率为98.92%，RSD=0.86%（n=9）。

2.1.10 样品测定：取2批样品按照供试品溶液制备方法制备，照上述含量测定方法测定，结果见表1。

2.2 紫外分光光度法（UV法）

2.2.1 样品的制备：（1）对照品溶液：精密称取硫酸阿托品对照品25.12mg，置25mL量瓶中，加水适量稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。（2）供试品溶液：精密量取硫酸阿托品注射液5mL置50mL量瓶中，加水稀释刻度，摇匀，精密量取5mL置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.3 测定方法：精密量取供试品溶液与对照品溶液各2mL，分别置预先精密加入三氯甲烷10mL的分液漏斗中，各加溴甲酚绿溶液（取溴甲酚绿50mg与邻苯二甲酸氢钾1.021g，加0.2mol/L氢氧化钠溶液6.0mL使溶解，再用水稀释100mL，摇匀，必要时过滤）2.0mL，振摇提取2分钟后，静置使分层，分取澄清的三氯甲烷液，照紫外-可见分光光度法，在420nm的波长处分别测定吸光度，计算并将结果乘以1.027即可。

2.2.4 线性范围考察：精密称取硫酸阿托品对照品适量，加水溶解并稀释成含硫酸阿托品0.001255，0.002510，0.00502，0.00753，0.01004mg·mL-1的 溶液，以上述方法测定吸光度，以浓度（mg·mL-1）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得回归方程：Y=-0.01792+90.3635X（r=0.9994），表明硫酸阿托品在（0.001255～0.01004）mg·mL-1与吸光度呈良好的线性关系

2.2.5 重复性试验：取天津药业集团新郑股份有限公司，批号1404171供试品，按上述方法进行操作，平行测定6次，记录吸光度，按外标法计算含量，得平均含量为102.7%,计算得RSD=2.24%。

2.2.6 回收率试验：按制剂处方配制空白辅料，称取9份处方量的空白辅料，分别置50mL量瓶中，按低（80%），中（100%），高（120%）3个水平配制供试品溶液，各3份，照上述测定方法进行测定，并计算回收率。结果表明，硫酸阿托品的平均回收率为96.67%，RSD=1.79%（n=9）。

2.2.7 样品测定：取4批样品按照供试品溶液制备方法制备，照上述含量测定方法测定，结果见表1。由UV、HPLC两种不同方法测定的结果绝对误差平均值为3.1。

表1 两种测定方法的结果比较

3 讨 论

3.1 对UV方法的评价 《中国药典2010年版二部》硫酸阿托品注射液含量测定方法，采用了与酸性染料溴甲酚绿定量结合成有色离子对，用有机溶剂三氯甲烷提取后进行比色测定，以吸光度计算含量，该方法操作步骤多，影响因素多，导致结果重复性差，回收率低。实验中的注意事项分别为：（1）应严格控制水相pH值并保证离子对化合物能定量提取进入三氯甲烷层。（2）振摇提取时既要能定量地将离子对化合物提取三氯甲烷层，又要防止乳化和少量水混入三氯甲烷层，因此需小心充分振摇，并时静置分层后在分取三氯甲烷，可在分液漏斗颈部放置少许脱脂棉以吸附三氯甲烷中少量水分。该方法对操作人员的技术要求较高。

3.2 对HPLC方法的评价 新建立的HPLC方法无需上述萃取过程，从而避免了许多导致误差的因素，由于HPLC仪器高度程序化、自动化，只需要实验前进行简单的定量稀释，仪器可以自动完成分离分析的全过程，操作人员的任务变轻了，节约了时间和人力成本，操作简单，快速，准确，重复性好，回收率高。

3.3 两种方法的比较评价 通过对比相同批次样品的测定结果，可知HPLC法测定结果低于UV法，分析可知HPLC法具有先分离后分析的特点，可以将样品中具有相同吸收的物质排除在外，而UV法则对相同波段具有吸收的物质特异性较差，因而含量测定的结果可能会偏高[3]。在两种方法的操作上，HPLC法自动化程度高，节约人力，节省时间，省却萃取环节，减少误差。同时，UV方法采用较多的氯仿进行萃取，对操作人员的健康以及环境都颇为不利。

最新版《中国药典2015年版二部》中硫酸阿托品注射液的含量测定依然采用UV法，故本文提议今后应进一步研究考察HPLC法在硫酸阿托品注射液含量测定中的应用，以便有关部门对方法进行科学的调整。

[1]李晓燕，吕杰.高效液相色谱法测定硫酸阿托品注射液的含量［J］.中国药业，2009，18（13）：29-30.

[2]杨强，金晓峰.高效液相色谱法测定硫酸阿托品注射液的含量［J］.中国畜牧兽医，2010，37（2）：221-222.

[3]戴志英，杨清华，叶青华.3种不同方法测定食品中铝残留量比较［J］.交通医学，2015，29（3）：312-314.