银翘散对呼吸道黏膜免疫功能低下合并甲型流感病毒感染模型小鼠的影响

柳丽松 殷红等

摘要：目的 观察银翘散对呼吸道黏膜免疫功能低下合并流感病毒感染模型小鼠的影响，并探讨其作用机制。方法 复制寒冷刺激致小鼠上呼吸道黏膜免疫功能低下模型，采用甲型流感病毒鼠肺适应株A/PR/8/34 （H1N1）通过鼻腔接种方式感染模型小鼠，将小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药（利巴韦林）组及银翘散组，各给药组给予相应药物灌胃，观察各组小鼠死亡率、生命延长率、平均存活时间及肺指数。结果 与模型组比较，阳性药组、银翘散组小鼠死亡率明显降低（P<0.05，P<0.01），存活时间延长；阳性药组、银翘散组小鼠肺指数明显降低（P<0.05，P<0.01），肺指数抑制率分别为35.5%、24.6%。结论 银翘散通过上调模型小鼠上呼吸道局部黏膜免疫功能，达到防治上呼吸道感染的作用。

关键词：银翘散；流感；黏膜免疫；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.019

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）08-0070-03

Effects of Yinqiao Powder on Mouse Models with Upper Respiratory Trace Mucosal Immunity Dysfunction Infected with Influenza Virus A LIU Li-song， YIN Hong， WANG Wei-li， YAN Han-wen， LIN Qing， Lei Na （Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China）

Abstract：Objective To observe the effect of Yinqiao Powder on the mouse models with upper respiratory trace mucosal immunity dysfunction infected with influenza virus A， and explore mechanism of action. Methods The mouse models of upper respiratory trace mucosal immunity dysfunction induced by cold stimulation with the influenza A/PR/8/34 （H1N1） virus through the nasal cavity were established. The mice were randomly divided into normal group， model group， positive medicine （Ribavirin） group， and Yinqiao Powder group. All administration groups received gavage with relevant medicine， and then mortality， the life prolonging rate， average survival time and the lung index of each group were observed. Results Compared with the model group， the mortalities in positive medicine group and Yinqiao Powder group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）， with longer survival time. The lung indexes in positive medicine group and Yinqiao Powder group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）， and the inhibition ratios of lung index were 35.5% and 24.6%， respectively. Conclusion Yinqiao Powder can realize the protective effects on upper respiratory infection through upregulating the mucosal immunity of the upper respiratory tract of mouse models.

Key word：Yinqiao Powder；influenza；mucosal immunity；mice

基金项目：国家中医药管理局中医药重点建设学科-培育学科（2012年）；云南省优势特色重点学科（群）建设项目（2011-2015年）；云南省科技计划青年项目（2013FD035）；云南白药、云南中医学院中医药教育创新基金项目（YB2014Y02）

通讯作者：雷娜，E-mail：492078820@qq.com

急性上呼吸道感染（以下简称“上感”）是临床常见的呼吸道传染病，70%～80%由病毒感染引起，仅少部分由细菌感染引起，病毒感染后亦可继发细菌感染，且易引起支气管炎及肺炎。采取抗病毒、抗菌的对因治疗及解热、镇痛和抗炎的对症治疗是治疗上感的主要方法，但由于目前用于上感治疗的抗病毒药物

仅对一种或几种病毒有效，加之病毒具有亚型多样性及快速变异性的特点，导致药物对因治疗的困难，非甾体类抗炎药物仅限于改善临床症状。因此，积极寻找防治上感的有效药物具有重要的现实意义。前期研究表明，解表方银翘散能提高模型小鼠呼吸道黏膜免疫功能[1]。本研究采用鼻腔接种甲型流感病毒鼠肺适应株A/PR/8/34（H1N1）感染呼吸道黏膜免疫功能低下小鼠模型，观察银翘散的体内抗流感病毒的作用，并探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

ICR小鼠，SPF级，5周龄，雌雄各半，体质量18～22 g，北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK（京）2009-0004，饲养于云南中医学院SPF级实验动物中心。

1.2 药物、主要试剂与仪器

按《方剂学》[2]银翘散的组成（连翘30 g，金银花30 g，桔梗18 g，薄荷18 g，牛蒡子18 g，淡竹叶12 g，甘草15 g，荆芥穗12 g，淡豆豉15 g），饮片均购自昆明一心堂大药房；利巴韦林片，江西汇仁药业有限公司，批号1302009。按人和动物的体表面积计算法[3]，根据临床药量换算出小鼠银翘散用量为21.84 g/kg利巴韦林用量为0.15 g/kg，给药体积均为0.2 mL/10 g。乙醚，云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司，批号101030；-80 ℃超低温冰箱，美国Thermo公司；-20 ℃冰箱，伊莱克斯公司。

1.3 病毒株

甲型流感病毒鼠肺适应株A/PR/8/34（H1N1），四川大学华西医学中心提供，-80 ℃保存备用。

2 方法与结果

2.1 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料用—x±s表示，组间比较采用方差分析；计数资料采用卡方检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2.2 上呼吸道黏膜免疫功能低下模型小鼠半数致死量测定

取冻存流感病毒液，复融后用生理盐水10倍连续稀释为10-1～10-66个浓度组备用，正常组给予生理盐水。实验小鼠随机分为7组，雌雄各半，每组10只。复制上呼吸道黏膜免疫功能低下模型[1]，室温下适应30 min，乙醚轻度麻醉，用移液枪经小鼠鼻腔接种10-1～10-6流感病毒液，0.05 mL/只，连续观察14 d，记录小鼠死亡数，按Reed-Muench法[2]计算流感病毒对小鼠的半数致死量（LD50）。测得本室保存的甲型流感病毒鼠肺适应株H1N1感染小鼠的LD50值为3.33。将病毒液做10-3.33稀释接种，可引起50%小鼠死亡，见表1。

2.3 银翘散对黏膜免疫功能低下合并流感病毒感染模型小鼠的影响

将小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组及银翘散组，每组20只。复制寒冷刺激致上呼吸道黏膜免疫功能低下小鼠模型[1]，小鼠室温下适应30 min，采用乙醚轻度麻醉小鼠，用移液枪经小鼠鼻腔接种引起小鼠LD50浓度流感病毒0.05 mL/只，阳性药（利巴韦林）组及银翘散组在滴鼻感染流感病毒前2 d开始给药，感染后1 h再给药1次，连续5 d，1次/d，记录14 d各组小鼠死亡数和平均存活时间及生命延长率。结果表明，与正常组比较，流感病毒感染模型小鼠死亡率为60%，阳性药组、银翘散组小鼠死亡率分别为15%、25%（P<0.05，P<0.01），延长模型小鼠平均生存时间，见表2。

（下同）

2.4 银翘散对黏膜免疫功能低下合并流感病毒感染模型小鼠肺指数的影响

实验动物分组、给药、造模及接种病毒方法同“2.3”项，小鼠于感染后第6日称重后摘眼球放血处死，取全肺称重，计算肺指数（全肺质量÷体质量×100%）及肺指数抑制率[（模型组平均肺指数-给药组平均肺指数）÷模型组平均肺指数×100%]。结果表明，利巴韦林、银翘散均能抑制模型小鼠肺指数（P<0.05，P<0.01），肺指数抑制率分别为35.5%、24.6%。银翘散组与阳性药组比较无明显差异，见表3。

3 讨论

辨证论治是中医理论的核心，是中医临床诊断、治疗疾病的基本原则。临床实践中，以中医理论为指导，对由症状组成的证候进行证的分辨确认，从而立法、选方、遣药对疾病进行治疗。恶寒、发热、鼻塞、喷嚏、流鼻涕、咳嗽、咽喉痒痛等是上感的主要症状，这些与中医表证的症状极其相似，中医往往将其归于表证的范畴进行辨证治疗[4]。根据辨证不同分别采用辛温解表的麻黄汤、辛凉解表的银翘散等解表方进行治疗，其中银翘散是临床上防治上感使用最为广泛、疗效较好的方剂[5-6]。但已有的对其防治上感的机制研究主要集中于解热、抗炎、抗病原体等方面[7]，其药效与化学药物相比并未表现出优势，难以解释其对上感良好的临床疗效。

为探究解表方防治上感的机制，本课题组前期基于呼吸道黏膜免疫功能低下是发生上感的重要条件的事实，建立了寒冷致小鼠上呼吸道黏膜免疫功能低下模型[1]，表明银翘散能提高模型小鼠上呼吸道黏膜免疫功能，对上呼吸道黏膜免疫功能低下合并鼻腔接种肺炎链球菌小鼠有生存保护作用，但对腹腔感染肺炎链球菌的模型无保护作用，也无体外抗菌作用。因此，我们认为银翘散可能是通过上调模型小鼠上呼吸道局部黏膜免疫功能，达到防治上感的作用[7]。由于上感主要由病毒感染引起，因此，本实验在寒冷致小鼠呼吸道黏膜免疫功能低下的模型基础上，采用鼻腔接种H1N1感染小鼠，观察银翘散体内抗流感病毒的作用，为进一步研究银翘散药防治上感的确切作用机制提供实验基础。

死亡率是一种表示宿主易感性及药物对病毒感染宿主的保护作用的实验指标，可从整体水平反映药效；对病毒感染动物生存的保护，包含药物对病毒增殖的抑制作用，也涉及药物对病毒感染机体的保护及对相应毒素的对抗作用。因此，动物的生存保护作用是研究中药抗病毒作用的常用指标。流感病毒感染后期常引起病毒性肺炎，因此，肺指数可作为流感病毒感染情况的指标[8]。

实验结果显示，银翘散对黏膜免疫功能低下合并鼻腔接种流感病毒小鼠有生存保护作用，能够降低模型小鼠死亡率、延长其生存时间、抑制肺指数。结合前期研究，银翘散不仅对黏膜免疫功能低下模型小鼠合并细菌感染有效，对黏膜免疫功能低下模型小鼠合并病毒感染也有效。因此，不能仅以抗病毒或抗菌解释其临床防治上感的作用。本研究结果表明，银翘散防治上感的作用与提高上呼吸道黏膜免疫功能有关。

参考文献：

[1] 李娴，雷娜，段小花，等.寒冷刺激致小鼠上呼吸道黏膜免疫功能低下模型的研究[J].中国病理生理杂志，2011，27（8）：1662-1664.

[2] 邓中甲.方剂学[M].北京：中国中医药出版社，2003：30.

[3] 徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2002：203.

[4] 余如瑾，唐光华，姜良铎.浅谈中医防治呼吸道病毒感染性疾病的辨治及研究思路[J].中国中医药信息杂志，2003，10（7）：79.

[5] 冯劲立，马霄行，周崇俊，等.三种解表方法对小鼠免疫功能影响的实验研究[J].世界中西医结合杂志，2007，2（5）：268-270.

[6] 周远鹏.银翘解毒片的药理研究[J].中成药，1990，12（1）：22-25.

[7] 雷娜，李艳，何芳雁，等.解表方通过调节黏膜免疫保护上呼吸道感染模型小鼠的研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（18）：174-176.

[8] Boeckh M， Englund JA. Evaluation of therapeutics for RSV：an important step forward[J]. Am J Respir Crit Care Med，2010， 182（10）：1217-1219.

（收稿日期：2015-02-09）

（修回日期：2015-02-26；编辑：华强）