透骨消痛胶囊对膝骨关节炎大鼠内质网应激影响的研究

叶锦霞 吴广文 赖舜淼 郑春松 李西海 刘献祥 叶蕻芝

【摘 要】目的：觀察透骨消痛胶囊对膝骨关节炎大鼠软骨内质网应激的影响，探讨透骨消痛胶囊治疗

骨关节炎的可能机制。方法：将30只清洁级SD大鼠随机分为正常对照组，模型对照组，透骨消痛胶囊高、中、低剂量组，每组6只。除正常对照组外，其余各组采用质量分数为4%的木瓜蛋白酶注射建立大鼠膝骨关节炎模型。给药8周后，收集大鼠右侧股骨髁和胫骨平台，光镜检查软骨组织的形态学变化，利用原位末端标记法（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）检测软骨细胞凋亡情况，免疫组化检测软骨组织内质网应激蛋白激酶（PKR-like ER kinase，PERK）、真核启动因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）、转录活化因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、免疫球蛋白结合蛋白（immunoglobulin binding protein，Bip）、生长抑制DNA损伤基因153（growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153，

GADD153）、软骨细胞功能基因Ⅱ型胶原蛋白（CollageⅡ）和转录因子SOX-9蛋白的表达。结果：透骨消痛胶囊对大鼠骨关节炎模型关节软骨的大体外观及HE染色均有明显改善，TUNEL结果显示其能够降低软骨细胞凋亡指数（P < 0.01），免疫组化结果显示透骨消痛胶囊较模型对照组能够下调PERK、eIF2α、ATF4、Bip及GADD153蛋白表达，上调软骨细胞功能基因CollageⅡ和SOX-9的蛋白表达

（P < 0.05或P < 0.01）。结论：透骨消痛胶囊可通过抑制内质网应激的信号转导，减少软骨细胞的凋亡数目，改善软骨细胞形态，促进软骨细胞代谢及软骨修复，以维持软骨结构的相对完整，从而延缓关节软骨退变。

【关键词】 骨关节炎，膝；透骨消痛胶囊；内质网应激；信号转导；大鼠

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.11.001

Study on the Effect of Tougu Xiaotong Capsule（透骨消痛胶囊）on CartilageEndoplasmic Reticulum

Stress in Rats with Knee Osteoarthritis

YE Jin-xia，WU Guang-wen，LAI Shun-miao，ZHENG Chun-song，LI Xi-hai，LIU Xian-xiang，YE Hong-zhi

【ABSTRACT】 Objective：To observe the effect of Tougu Xiaotong Capsule （透骨消痛胶囊，TXC） on cartilage endoplasmic reticulum stress in rats with knee osteoarthritis in order to study its possible mechanism of treating osteoarthritis.Methods：Thirty clean SD rats were randomly divided into a normal control group，a model control group，and high，medium and low dose groups of TXC （HTXC group，MTXC group and LTXC group），

6 rats in each group.Except for the normal control group，the rest groups were given injections of 4% papain to establish rat models of knee osteoarthritis.After 8 weeks of medication，right lateral thighs and tibial plateaus of rats were collected to detect the morphological changes of cartilage tissue with light microscope.TUNEL （TdT-mediated UTP nick-end labeling） was used to detect chondrocyte apoptosis.Immunohistochemisty was used to detect the expressions of PERK （PKR-like ER kinase），eIF2α （eukaryotic translation initiation factor 2α），ATF4 （activating transcription factor 4），Bip （immunoglobulin binding protein），GADD153 （growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153），CollageⅡ and transcription factor SOX-9.Results：TXC could significantly improve the general appearance and HE staining of articular cartilage of rat models.The results of TUNEL showed the decrease of chondrocyte apoptosis index （P < 0.01）.Immunohistochemistry results showed the down-regulation of the expression of PERK，eIF2α，ATF4，Bip and GADD153 and the up-regulation of the expression of CollageⅡ and SOX-9 （P < 0.05 or P < 0.01）.Conclusion：TXC，by way of inhibiting endoplasmic reticulum stress signal transduction，can reduce the number of chondrocyte apoptosis，improve the morphology of chondrocytes，promote the metabolism of chondrocytes and cartilage repair，and maintain relatively intact cartilage structure，to delay the degeneration of articular cartilage.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；Tougu Xiaotong Capsule（透骨消痛胶囊）；endoplasmic reticulum stress；

signal transduction；rat

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）

是指由于各种原因使得细胞内质网发生功能紊乱，导致错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集以及Ca2+离子平衡紊乱的亚细胞器病理状态[1]。ERS

是机体对外界或自身反应的一种自我保护机制，以维持内质网的稳态，促进细胞生存，但过强或持续时间过长的ERS可以诱导细胞凋亡[2-3]。采用福建中医药大学附属第二人民医院院内制剂透骨消痛胶囊治疗早、中期骨关节炎（osteoarthritis，

OA），经临床长期观察，疗效可靠[4-8]。本研究从ERS角度观察其对膝骨关节炎（knee osteoarthritis，

KOA）大鼠软骨组织的影响，探讨其防治OA的作用机制。

1 实验材料

1.1 實验药物 透骨消痛胶囊由巴戟天、白芍、川芎和肿节风组成，为福建中医药大学附属第二人民医院的院内制剂（批准文号：闽制字Z20100006）。

1.2 实验动物 健康2月龄清洁级SD大鼠30只，雄性，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号：SCXK（沪）2007-0005。福建中医药大学实验动物中心提供的清洁级医学实验动物环境设施，使用许可证号：SYXK（闽） 2009-0001。实验中对动物处置符合科技部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.3 主要试剂 木瓜蛋白酶（美国Genview公

司）；TUNEL检测试剂盒（美国罗氏公司）；PERK，eIF2α，ATF4，Bip，GADD153，CollageⅡ和SOX-9一抗（北京博奥森生物技术有限公司）；（H+L） Goat anti Rabbit IgG（北京中杉金桥公司）；免疫组化染色MaxVISion试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；DAB显色试剂盒（上海碧云天公司）。

1.4 主要仪器 生物组织石蜡包埋机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司）；生物组织自动脱水机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司）；全自动石蜡切片机（德国Leica公司）；IX70倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；多功能真彩色细胞图象分析管理系统（美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus）。

2 方 法

2.1 实验分组及动物模型制备 动物适应性喂养1周后，抽签法随机分为两组，即正常对照组（6只）和实验组（24只）。实验组大鼠第1，4，7 d，采用质量分数为2%的戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）麻醉成功后[9-10]，于右膝关节处剔毛，分别用碘酒、酒精消毒右后膝关节；将关节微屈，经髌腱内侧进针，关节腔内注射质量分数为4%的木瓜蛋白酶生理盐水溶液 0.2 mL，隔3 d注射1次，共注射3次，复制OA模型[11]。正常对照组注射等量生理盐水。

造模后2周，实验组采用抽签法随机分为4组，即模型对照组，透骨消痛胶囊高、中、低剂量组，每组6只。

2.2 药物剂量设置 根据人体与动物药物等效剂量换算[12]方法，透骨消痛胶囊的高剂量为7.2 g·kg-1、

中剂量为3.6 g·kg-1、低剂量为1.8 g·kg-1，分早、晚2次灌胃，正常对照组和模型对照组给予等量生理盐水灌服，连续8周。

2.3 动物取材 各组分别于药物或生理盐水干预8周后，用质量分数为2%的戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）

腹腔注射麻醉；采集大鼠右侧股骨髁和胫骨平台，切取胫骨平台，用质量分数为10%的多聚甲醛固定、用质量分数为10%的EDTA脱钙剂脱钙4～6周，

石蜡包埋，用苏木素-伊红（HE）染色、TUNEL和免疫组化检测。

2.4 指标检测

2.4.1 大体观察 实验动物处死后，各组动物取右侧股骨髁和胫骨平台，肉眼大体观察软骨面情况。

2.4.2 HE染色观察组织形态 光镜下观察软骨形态学变化。

2.4.3 TUNEL检测软骨细胞调亡 计算凋亡指数（apoptosis index，AI），即每张TUNEL切片选取5个阳性细胞数最多的高倍镜视野，每个视野计算100个软骨细胞，计算阳性细胞数与总细胞数的百分比。

2.4.4 免疫组化染色 观察软骨组织中ERS相

关蛋白PERK、eIF2α、ATF4、Bip、GADD153，以及软骨细胞功能基因CollageⅡ和SOX-9蛋白的

表达。

2.4.5 显微照相和图像分析 在200倍镜下每份样本随机选取5个视野，获取图像并编号、存盘。采用多功能真彩色细胞图像分析管理系统，分析所获取的图片并得出阳性细胞数百分率（PERK、eIF2α、ATF4、Bip、GADD153共5个指标）。阳性细胞数分级：0级，0～1%；1级，> 1%～10%；

2级，> 10%～50%；3级，> 50%～80%；4级，>

80%～100%。测出图像中阳性表达积分光密度（Integrated option density，IOD）（CollageⅡ及SOX-9两个指标），5个视野的平均值作为该样品的积分光密度供统计使用。

2.5 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用One-Way ANOVA方差分析，多重比较采用SNK-q检验；计数资料采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 动物模型鉴定结果

3.1.1 大体形态观察 正常对照组大鼠关节软骨呈淡蓝色且色泽清亮，表面光滑无裂痕，无纤维化和骨赘形成，见图1（1）；模型对照组大鼠关节软骨色泽灰暗苍白，且关节表面可发现凹陷或缺损，见图1（2）。

3.1.2 显微镜下形态观察 软骨HE染色显示正常对照组关节表面光滑，四层结构清晰，软骨分布均匀，未见软骨细胞簇集和炎性细胞浸润，见图2

（1）；模型对照组关节表面纤维性成分多，且凹凸不平，光滑度不如正常软骨，表层细胞明显减少，细胞“背靠背”现象消失，深层细胞出现了簇集现象，见图2（2）。

3.2 一般情况观察 正常对照组精神状态良好，膝关节活动自如，毛色无异常变化。造模后，部分动物出现关节肿胀，膝关节活动明显受限，自主活动减少。正常对照组关节软骨表面光滑，色泽如常，未见明显软骨损伤；模型对照组关节软骨表面粗

糙，色泽较暗，部分软骨见缺损和裂隙；透骨消痛胶囊组关节软骨损伤程度较模型对照组轻，部分软骨可见表面稍微粗糙，有凹陷，但未见缺损。

3.3 HE染色结果 正常对照组关节软骨表面光滑，四层结构清晰可辨，各层次排列规律，表层细胞较小呈梭形，排列密集，其长轴平行于软骨表面。中间层细胞较大呈圆形或椭圆形，排列无规律，呈双细胞“背靠背”分布。肥大细胞层细胞大，由双细胞逐渐过渡到多细胞成团分布。软骨细胞周围基质染成蓝色，以放射层为中心往上下层染色渐淡；潮线整齐；软骨下骨致密层厚度适中，骨松质层骨小梁宽度和密度适中，骨细胞呈梭形，分布均匀，骨基质均匀红染[13]。见图3（1）。

模型对照组关节软骨层表面粗糙，变薄，完整性破坏，表层软骨纤维化变性；部分区域软骨较正常对照组局部增厚，软骨细胞明显增殖，排列紊乱，有簇聚现象，细胞“背靠背”现象消失，局部软骨细胞凋亡，无肥大细胞存在，基质纤维化；潮线不整齐；软骨下骨部分致密层变薄，软骨下骨增生，长入软骨层，髓腔扩大、开放。见图3（2）。

透骨消痛胶囊高、中、低剂量组软骨组织损伤情况比模型对照组轻，软骨表面裂隙较少，部分区域仍有软骨细胞排列不规则现象，但明显优于模型对照组，表层细胞形态接近正常，深层结构变化不明显，四层结构欠清晰，个别区域有簇集现象，潮线较整齐。见图3（3）、3（4）、3（5）。

3.4 TUNEL凋亡结果 应用Tunel法对软骨细胞凋亡情況进行组织原位末端标记检测，发现正常对照组软骨细胞也存在凋亡现象，有个别细胞呈棕黄色染色，见图4（1）；模型对照组棕褐色染色细胞明显增多，见图4（2）；凋亡率明显增高，透骨消痛胶囊给药后，高、中、低剂量组细胞棕黄色染色细胞比模型对照组少，见图4（3）、4（4）、4（5），凋亡指数较模型对照组显著降低（P < 0.01），且有剂量依赖性。见表1。

3.5 免疫组化染色结果 光镜显微镜下，细胞核或细胞浆出现棕黄色或棕褐色染色的部分为阳性，蓝染为苏木素复染的阴性。CollageⅡ和SOX-9中细胞及基质棕黄色或棕褐色为阳性，蓝染为阴性。与正常对照组比较，模型对照组和透骨消痛胶囊高、中、低剂量组PERK、eIF2α、ATF4、Bip和GADD153蛋白阳性率均有明显提高，软骨细胞功能基因CollageⅡ和SOX-9 蛋白表达量均降低。透骨消痛胶囊给予7.2 g·kg-1、3.6 g·kg-1、1.8 g·kg-1剂量后，PERK、eIF2α、ATF4、Bip和GADD153蛋白阳性率较模型对照组显著降低（P < 0.01），CollageⅡ和SOX-9 蛋白表达量较模型对照组不同程度提高（P < 0.05或P < 0.01）。透骨消痛胶囊能改善质量分数为4%的木瓜蛋白酶所致大鼠软骨组织相关蛋白的异常变化，能改善木瓜蛋白酶造成的软骨组织损伤。见表2、表3，图5-11。

4 讨 论

木瓜蛋白酶关节腔内注射诱发OA是一种常用的KOA造模方法，其诱发OA病变模型的病理变化与临床OA极为相似，造模过程简单，成功率高，发生时间短，适合快速大批量建立OA模型进行软骨病理、药物防治的研究。OA中关节软骨的形态变化，关节软骨退行性改变及破坏是其基本病变，其病理改变的程度直接反映软骨的退变情况。观察OA病理进程及药物疗效最直观的办法即观察OA软骨组织形态学的改变。故本实验采用木瓜蛋白酶关节腔注射建立大鼠OA模型，在造模8周后，大体观察即发现模型对照组关节软骨表面粗糙，色泽较暗，部分软骨见缺损；软骨组织切片HE染色中发现，软骨细胞呈簇集样改变或者数量明显减少，软骨结构层次紊乱不清楚，失去正常结构，从而证明本实验成功复制出大鼠KOA模型，模拟了KOA的病理改变过程。

本研究结果显示，给予透骨消痛胶囊8周时，通过肉眼观察，与模型对照组相比，软骨颜色变浅，软骨缺损等现象均有不同程度好转。通过光镜观察可见透骨消痛胶囊高、中、低剂量组软骨组织损伤情况比模型对照组轻，软骨表面裂隙较少，部分区域仍有软骨细胞排列不规则现象，但明显优于模型对照组，表层细胞形态接近正常，深层结构变化不明显，四层结构欠清晰，个别区域有簇集现象。TUNEL法检测显示透骨消痛胶囊各给药组棕黄色染色细胞数量明显比模型对照组少，说明透骨消痛胶囊在一定程度上能减轻膝关节组织粘连，消除局部无菌性炎症，改善微循环，减少关节内压力；减轻软骨组织形态结构的损伤程度，延缓软骨退变，减缓OA的病变进程。

内质网是重要的细胞器之一，其功能主要是膜蛋白和分泌性蛋白的折叠、蛋白质糖基化修饰、蛋白质的分泌等。各种理化因素，如紫外线、缺氧、营养物质缺乏、病毒、氧化应激等均可使内质网发生应激反应。近年对ERS的研究发现，过度的ERS反应可以导致软骨细胞的凋亡，这是独立于Fas途径和NO途径的细胞凋亡途径。在应激条件下，细胞可以整合应激反应，调动应激反应蛋白减轻应激因素对细胞的损伤，使内质网适应新的内环境要求；同时细胞表达的ERS蛋白如GADD153、Caspase-12等，也可以启动细胞凋亡来处理不能修复的损伤细胞。ERS有3条信号通路：ATF-6（activating transcription factor 6）、Ire1（inositol-requiring 1）和PERK。3条通路可以通过TRAF-2（TNF receptor-associated factor 2）和GADD153启动细胞凋亡基因，使软骨细胞凋亡。其中PERK信号分子的激活可以磷酸化，后者可以激活ATF-4，上调GADD153的表达和下调细胞内整体蛋白质的合成水平，包括细胞生存必须的蛋白质。研究表明，在OA患者的软骨细胞中存在ERS，并且随着病情的发展，内质网过载，会通过GADDA153和CHOP的高表达诱导软骨细胞的

凋亡。

本实验结果证实，透骨消痛胶囊对大鼠KOA有治疗作用，能减轻过度的ERS反应，保护关节软骨，减轻软骨损伤。

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收稿日期：2015-07-16；修回日期：2015-08-31