miR-17表达对内皮细胞氧化应激作用的影响

杨硕，陈静，胡琦，江洪

论著·基础

miR-17表达对内皮细胞氧化应激作用的影响

杨硕，陈静，胡琦，江洪

目的 探讨microRNA-17(miR-17)表达对内皮细胞氧化应激作用的影响。方法 培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，分别转染阴性对照病毒[Ad(N)组]、上调miR-17腺病毒(Ad-Pre-miR-17组)及下调miR-17腺病毒(Ad-Antagomir-17组)，用硝酸银法检测细胞内源性NO的释放，DAF FM探针检测细胞内NO含量，以及采用DHE探针检测细胞内超氧化物(ROS)的含量，并进行统计分析。结果 与Ad(N)组比较，Ad-Antagomir-17组细胞内NO含量提高(P<0.05)，细胞内ROS含量降低(P<0.05)；而Ad-Pre-miR-17组细胞内NO含量降低(P<0.05)，细胞内ROS含量增加(P<0.05)。结论 降低miR-17可以改善冠心病患者血流供应，降低氧化应激反应，有助于其血管功能的改善。

miR-17；内皮细胞；一氧化氮；氧化应激

经皮冠状动脉介入术(PCI)是冠心病治疗的重要手段，术后主要问题是容易出现支架内再狭窄和晚期支架内血栓[1，2]，可以导致再次血运重建及心脏不良事件发生率明显升高[3，4]。研究证实内皮损伤修复延迟是其共同的病理生理基础[5，6]，促使损伤部位早期形成功能完全的完整内皮层对于提高PCI 的有效性和安全性都具有重要意义。

microRNA 是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长约20～25 个核苷酸，成熟的microRNA 通过2 种途径负向调节基因表达，即在翻译水平上阻止蛋白合成和引起目的基因mRNA 的剪切降解[7]。有研究表明miR-17在内皮细胞(EC)中含量非常丰富[8]，在肿瘤组织中发现miR-17 具有抗血管形成的能力，抑制其表达可提高内皮细胞体外血管生成密度[9，10]。由此我们推断，对于损伤后血管内皮细胞，miR-17过表达可能导致内皮细胞损伤修复延迟。现从氧化应激方面阐述miR-17对内皮细胞的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购买于美国Sciencell公司(Cat:8000)，内皮细胞专用培养基(ECM)(美国Sciencell公司)，DAF FM探针及DHE探针购买于美国invitrogen公司，NO试剂盒购买于南京建成公司。

1.2 内皮细胞培养 原代HUVEC用内皮细胞专用培养基(ECM)进行细胞培养，培养基中含有5%胎牛血清(FBS)，1%内皮细胞生长因子(ECGS)以及1%双抗。每2天换一次液，细胞融合达80%～90%时用胰酶消化传代，传至4～6代时进行病毒转染。

1.3 实验方法 病毒转染：委托上海吉凯公司成功构建携带miR-17表达序列的腺病毒(Ad-Pre-miR-17)，用于上调内皮细胞中miR-17的表达水平；同时构建携带miR-17反义序列的腺病毒(Ad-Antagomir-17)，用于抑制miR-17的活性，下调内皮细胞中miR-17的含量；用含有相同基因片段，但不对体内microRNA产生干扰的腺病毒[Ad(N)]作为阴性对照。上述培养细胞，融合达80%～90%时，用胰酶消化计数，种于直径60 mm的小皿之中，每皿调整细胞计数为6×105个，放入培养箱中培养过夜，使之贴壁。用不含血清及生长因子的基础培养基同步化24 h后，分别按感染复数MOI=15/20/30/40转入上述3组腺病毒，分为Ad-Pre-miR-17组、Ad-Antagomir-17组以及Ad(N)组。在无血清的培养基中培养4 h后，去除含病毒的培养液，加入完全培养基继续培养72 h，荧光显微镜检测转染效率。

1.4 观测项目

1.4.1 一氧化氮(NO)测定：(1)硝酸银法测细胞内源性NO释放：收集上述转染病毒72 h后的细胞培养液，用南京建成公司的NO检测试剂盒检测上清液中的NO含量，具体做法参照说明书进行。(2)DAF-FM探针测细胞内NO含量：用DAF FM探针检测细胞内NO的含量。将上述转染病毒的细胞分别消化计数，种于24孔板中，每孔调整细胞计数为105，过夜使之贴壁，吸去原有培养基，加入含有DAF-FM的无血清培养基5 μmol/ml，在培养箱中培养30 min后，在荧光显微镜下观察细胞的平均荧光强度，每孔随机拍取6张照片，取平均荧光强度。

1.4.2 ROS荧光探针-DHE探针测内皮细胞氧化应激水平：用DHE探针检测细胞内超氧化物(ROS)的含量。将上述转染病毒的细胞分别消化计数，种于24孔板中，每孔调整细胞计数为105，过夜使之贴壁，吸去原有培养基，加入含有DHE(10 μmol/ml)的无血清培养基，在培养箱中培养30 min后，在荧光显微镜下观察细胞的平均荧光强度，每孔随机拍摄6张照片，取平均荧光强度。

2 结 果

2.1 病毒转染效率 荧光显微镜下随机选取6个视野计算绿色荧光细胞数及总细胞数检测转染效率，计算得出在MOI=30时转染效率较高并且细胞状态较好，漂浮细胞数少。Ad-Antagomir-17组转染效率为81.2%，Ad(N)组转染效率为79.8%，Ad-Pre-miR-17组转染效率为80.6%，各组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图1(见封3)。

2.2 miR-17对内皮细胞一氧化氮(NO)的影响

2.2.1 硝酸银法检测结果：下调miR-17可以促进内皮细胞内源性NO的释放，Ad(N)组NO释放量为(113.0±3.1)μmol/L，Ad-Antagomir-17组NO释放量为(138.7±4.2) μmol/L，比Ad(N)组增加了(22.7±5.236)%；相反，上调miR-17可以抑制内皮细胞内源性NO 的释放，Ad-Pre-miR-17组NO释放量为(35.23±1.0) μmol/L，比Ad(N)组下降了(68.8±3.3)%，2组比较具有统计学意义(P<0.05)。见图2A。

2.2.2 DAF-FM探针检测结果：下调miR-17可以促进内皮细胞内NO 的产生，Ad(N)组DAF-FM平均荧光强度为28.3 ± 1.7，Ad-Antagomir-17组DAF-FM平均荧光强度为44.4 ± 2.1，比Ad(N)组增加了(57.0±2.8)%；相反，上调miR-17可以抑制内皮细胞内NO 的产生，Ad-Pre-miR-17组DAF-FM平均荧光强度为18.3 ± 1.3，比Ad(N)组下降了(35.3±2.1)%，2组比较具有统计学意义(P<0.05)。见图2B，图3(见封3)。

2.3 miR-17对内皮细胞内超氧化物(ROS)含量的影响 下调miR-17可以降低内皮细胞内ROS的含量，Ad(N)组DHE平均荧光强度为28.3 ± 1.7，Ad-Antagomir-17组DHE平均荧光强度为18.0 ± 1.4，与Ad(N)组相比降低了(36.5±2.2)%，而上调miR-17则可以使内皮细胞内超氧化物含量增加，Ad-Pre-miR-17组DHE平均荧光强度为45.5 ± 3.7，与Ad(N)组相比增加了(60.8±4.2)%(P<0.05)。DHE探针检测结果见图4，图5(见封3)。

2 讨 论

目前已发现miR-17在肿瘤组织中具有抗血管形成的能力，下调miR-17还可以促进糖皮质激素介导的成骨细胞的分化和功能,此外其还与B细胞淋巴瘤、急性自身免疫性疾病等疾病有关[11～13]。近来研究发现，一些miRNA与心脏疾病的病理生理过程相关[14]。但是关于miR-17与心脏疾病的研究并不多。在大鼠颈总动脉损伤修复过程中，研究提示miR-17 表达持续升高；而促血管形成的miR-18a 和miR-19a 表达无明显改变，之前还有研究证实miR-17与肿瘤组织的增殖和凋亡有关，我们前期实验也证实miR-17可能与内皮细胞的迁移增殖有关[15]。由此我们猜测，miR-17可能与内皮细胞的其他功能如氧化应激等有关。

注：与Ad(N)组比较，aP<0.05

注：与Ad(N)组比较，aP<0.05

大多数情况下，内皮功能紊乱都是由于体内ROS过多导致的。ROS的体内生理平衡是由O2-生成酶和抗氧化剂共同决定的[16]。氧化应激形成是体内抗氧化系统如SOD、GSH-PX、GSH等防御机能减弱或是体内ROS产生过多的结果[17]，使机体处于易损状态。实验证实ROS可导致内皮细胞生物膜脂质过氧化，降低膜的流动性，增加内皮细胞膜的通透性，引起内皮细胞肿胀，从而导致冠状动脉血流量下降，加重血管及心肌损伤[18]。ROS还破坏内皮细胞源性一氧化氮合酶和四氢叶酸(一氧化氮合酶的重要辅助因子)的生物活性，导致NO合成减少[19]。此外，ROS还可以激活转录因子，促进黏附分子的表达，促进白细胞与内皮细胞的黏附作用，进而加重白细胞聚集，微血管阻塞。此外，ROS抑制细胞Na+-K+-ATP酶和内质网Ca2+-ATP酶的活性，从而导致细胞内钙超载，从而进一步导致冠状动脉血流量减少[20]。NO不但可以使血管舒张，阻止血小板聚集，抑制黏附分子(CD11/CD18)表达[21]。因此，NO合成减少可引起冠状动脉血管收缩，血小板黏附、聚集形成微血栓，白细胞对内皮细胞的损伤增强，从而加重血管损伤并延迟其修复。

研究证实，氧化应激与多条通路有关，比如STAR、p38MAPK、PI3K/AKT、MEK/ERK等[22]。与内皮相关的通路大多为PI3K/AKT通路和MEK/ERK通路，本实验证实，miR-17对内皮细胞ROS及NO具有调节作用，是否通过上述通路亦或者是通过多条通路共同作用目前尚不清楚，需要进一步研究证实。

综上所述，下调miR -17对冠心病患者具有保护作用，而上调miR-17则作用相反。miR-17对冠心病患者血流供应的改变究竟只是通过氧化应激的作用还是通过对损伤血管的修复作用，还有待进一步的研究，而其对内皮细胞氧化应激的作用机制目前亦尚不明确，还需后续实验进一步研究证实。

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The effect of microRNA-17 expression on oxidative stress in endothelial cells

YANGShuo,CHENJing,HUQi,JIANGHong.DepartmentofCardiology,RenminHospital,WuhanUniversity,HubeiProvince,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:JIANGHong,E-mail:phyhongj@163.com

Objective To investigate the effect of microRNA-17 (miR-17) expression on endothelial cell oxidative stress.Methods Cultured original generation umbilical vein endothelial cells (HUVEC), they were transfected to negative control virus [Ad(N) group], up-regulation of miR-17 adenovirus (Ad-Pre-miR-17) and down-regulation of miR-17 adenovirus (Ad-Antagomir-17 group), the release of endogenous nitric oxide (NO) is detected by the silver nitrate method, the content of NO in DAF FM probe for the detection of cell, and used DHE probe for the detection of cell super oxide (ROS) content and analyzed.Results Compared to Ad (N) group, the content of NO in Ad-Antagomir-17 cell group increased (P<0.05), intracellular ROS content decreased (P<0.05); and reduce the content of NO in Ad-pre-miR-17 cells (P<0.05), intracellular ROS increased (P<0.05). Conclusion Reduce miR-17 can improve blood supply in patients with coronary heart disease, reduce oxidative stress and help to improve vascular function.

MicroRNA-17; Endothelial cells; Nitric oxide ; Oxidative stress

国家自然科学基金资助项目(No.81170195；81200156)

430060 武汉大学人民医院心血管内科

江洪，E-mail:phy-hongj@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.11.023

2015-04-23)