响应曲面优化固定化微生物修复石油污染土壤

张 涵，韩雨彤，张守娟，丁 铮，张秀霞

(中国石油大学 环境与安全工程系， 山东 青岛266580)

响应曲面优化固定化微生物修复石油污染土壤

张 涵，韩雨彤，张守娟，丁 铮，张秀霞

(中国石油大学 环境与安全工程系， 山东 青岛266580)

采用秸秆载体DG吸附高效石油降解菌SJ5-1制备固定化微生物。在花盆中模拟固定化微生物修复石油污染土壤，采用单因素实验考察wC∶wN∶wP(有机质、全氮、速效磷的质量分数的比值)、含水率、接种量对石油烃降解率的影响，再通过Design-Expert 8.06响应曲面法设计实验，建立多元二次回归方程预测模型，进一步确定固定化微生物的最佳实验参数组合，并在最佳参数条件下验证模型的准确性。结果表明，预测模型准确；在土壤含油率为4.72%(质量分数)时，固定化微生物修复35 d，响应面优化得到固定化微生物最佳降解条件为wC∶wN∶wP=100∶9.79∶1，接种量10.34%、含水率17.8%(质量分数)，石油烃降解率为42.4%，高于单因素最优条件时的40.8%；对石油烃降解率影响的显著性从大到小的因素依次是接种量、含水率、wC/wN。

固定化微生物；石油污染土壤；响应面；优化条件

随着石化工业的发展，在石油勘探、开采、运输及储存过程中，由于意外事故或管理不当，导致石油排放到土壤田间，使土壤环境遭受污染，直接危害人类生产与生活。20世纪80年代以前，土壤修复方法主要是物理法和化学法。由于难以大规模实施、对土壤结构造成破坏、产生二次污染等缺陷[1]，限制了这两种方法的应用。20世纪80年代以来，生物修复技术因其无污染、无毒害得到了人们的重视[2]，在土壤修复领域中取得了很大进步。然而，传统微生物修复技术往往对多变的环境条件抵抗力弱，导致降解效率不高。秸秆在土壤中易被生物降解、来源广，不仅对土壤结构无害，而且可改善土壤理化性质，应用在土壤修复中是一种理想的土壤调理剂和微生物的载体[3-4]。近年来，秸秆载体[5-7]的固定化微生物在石油污染土壤修复中脱颖而出。关于固定化微生物在土壤中降解条件的优化研究尚少，研究多集中在制备条件等方面。有学者提出修复土壤工程启动前，需要调节土壤条件[8-9]，以保证微生物高效修复。

响应面法(Response surface method，RSM)是通过对响应曲面及等高线的分析，利用多元二次回归方程来拟合响应值与各因素之间的函数关系[10]，依此从响应曲面上找到最佳控制点，寻求最优工艺参数。与正交法相比，响应面法可以连续地对试验因素的各个水平进行分析，在实验设计与结果表达方面具有较大的价值，在污染修复中的应用[7,11]也有相关报道。

笔者采用前期筛选出的天然有机秸秆DG为载体，采用吸附法制备固定化微生物。利用响应曲面法优化降解条件，考察各自变量及其交互作用对降解效果的影响，建立多元二次回归方程，得出降解优化条件，为秸秆固定化微生物在土壤修复的应用提供技术参数。

1 实验部分

1.1 供试土壤

供试土壤为新疆风城油田作业区附近被石油污染的土壤。对其进行风干，去除粒径大的植物残体和砂砾，碾碎，贴标签，装瓶置于4℃冰箱，备用。

1.2 供试菌种

所用菌种为实验前期筛选出的原油降解菌SJ5-1。菌落呈黄褐色、圆形、大小均匀、边缘整齐，革兰氏阴性，无芽孢，吲哚实验、淀粉水解实验、甲基红实验均为阴性，接触酶实验为阳性，初步鉴定为无色杆属(Chromobacter)细菌。

1.3 实验方法

1.3.1 固定化微生物制备

取已粉碎、筛分至40目的秸秆载体DG装入锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20 min。将其与石油高效降解菌SJ-1活化好的菌液按体积比1∶5混合，于30℃、160 r/min摇床培养24 h。倒掉上层培养基，用生理盐水将载体材料转移到离心管中，在离心机中1000 r/min下离心5 min后，弃去上清液。重复2次，离心所得沉淀即为固定化微生物[7]。

1.3.2 固定化微生物的生物量测定

将2.0 g固定化微生物加入锥形瓶中，加入50 mL无菌水，于160 r/min培养0.5 h。取上层菌液1 mL以10倍为1个梯度进行稀释，涂布平板，培养，计数。游离菌培养液中细菌数量的确定亦取1 mL菌液稀释，涂布平板计数。计算1 mL游离菌菌液与1 g固定化微生物细菌数量之间的关系。得到固定化微生物生物量为8.08×1012个/g，游离菌液细菌数量9.42×1011个/mL，等生物量换算，8.08×1012/(9.42×1011)=8.58 mL/g，即1 g固定化微生物相当于8.58 mL游离菌菌液。

1.3.3 土壤和秸秆理化性质测定

采用超声-萃取紫外分光光度法[12]测定土壤石油烃含量；采用重量法测定土壤含水率；参考国家标准NY/T 1377-2007，采用电极电位法(pHS-3酸度计)测定土壤pH值；采用重铬酸钾容量法测定土样的有机质含量；采用半微量凯氏法测定土样的总氮含量；采用钼锑抗比色法测定土样的速效磷[13]。

土壤及秸秆的理化性质见表1。

表1 供试土壤及秸秆的理化性质

1.3.4 单因素实验

实验选取wC∶wN∶wP、含水率、固定化微生物接种量3个因素。通过单因素实验考察各个因素对原油降解率的影响，分别确定固定化微生物降解率最好的降解条件。

(1)在4个相同花盆中分别装500 g土样。以摩尔比为1的硫酸铵和硝酸钠为氮源，磷酸二氢钾为磷源，溶于少量水中。根据实验室的前期研究，调节土壤wC∶wN∶wP(有机质、全氮、速效磷的质量分数比)为100∶2∶1、100∶5∶1、100∶10∶1、100∶20∶1，添加固定化微生物接种量10%(1 g土样含0.1 mL游离菌)(根据等生物量换算结果，按500 g土样含50 mL游离菌计算固定化微生物添加量)，含水率维持在20%左右[14]。每天浇水、翻耕，在30℃的恒温培养箱中培养35 d，每7 d测定土壤石油烃含量，得出最佳wC∶wN∶wP。

(2)为了考察固定化微生物对土壤含水率的适应范围，设置含水率分别为8%、14%、18%、23%(质量分数)的土壤，采用(1)实验中得出的wC∶wN∶wP，接种量10%，修复35 d，得出最佳含水率。

(3)为了避免实际应用中降解效率不高及降解菌和载体的浪费，实验确定最佳的固定化微生物接种量。分别向土壤中添加5%、10%、15%、20%的固定化微生物，采用 (1)、(2)实验得出的wC∶wN∶wP、含水率， 修复35 d，得出最佳接种量。

1.3.5 响应面优化实验

采用响应面优化Box-Behnken Design(BBD)实验设计模型，按wC∶wN∶wP、含水率、接种量3个因素对修复效果的影响进行优化实验，利用回归方程优化实验条件，确定石油烃降解率最高时的实验条件组合。

2 结果与讨论

2.1 单因素对固定化微生物修复污染土壤石油烃降解率的影响

2.1.1wC∶wN∶wP的影响

初始含油率为4.72%的供试土壤，在不同wC∶wN∶wP条件下，固定化微生物修复35 d，石油烃降解率随时间的变化如图1所示。

从图1可以看出，固定化微生物的石油烃降解率随时间的延长而增大，补充氮源、磷源，降解效果明显。wC∶wN∶wP为100∶2∶1、100∶5∶1、100∶10∶1、100∶20∶1时，在初始含油率为4.72%的土壤石油烃降解率分别为25.1%、28.1%、34.9%、26.5%。随着N源的增加，石油烃降解率也随之增加，wC∶wN∶wP比为100∶10∶1时降解率达到最大值；N源继续增大，降解率反而降低，说明N源过多，会影响石油烃的降解率。

图1 不同wC∶wN∶wP下固定化微生物修复污染土壤的石油烃降解率随时间的变化

微生物对氮源的敏感度大[15-17]，氮源含量过低，不能满足微生物的需要，限制了微生物活性，导致石油烃降解率较低；秸秆固定化微生物的加入，对土壤的N源有一定的贡献值；wC∶wN∶wP为100∶20∶1，氮源过高，碳源不足，造成氮源的浪费，不利于石油烃的降解。因此，秸秆DG固定化微生物修复石油污染土壤时应保持营养物质的平衡，才能达到高效降解的效果。

2.1.2 含水率的影响

初始含油率为4.72%的供试土壤，在不同含水率的条件下，固定化微生物修复35 d，石油烃降解率随时间的变化如图2所示。

从图2可以看出，在不同含水率下，石油烃降解率随着固定化微生物修复时间的延长呈不同程度增大。含水率在18%时，降解率最高达到38.5%；含水率23%左右时，降解率反而最低。微生物的生长繁殖离不开水，土壤含水率过低，土壤中微生物不活动，达不到生长的需求，微生物的呼吸作用减弱，影响对石油烃的降解[18]；土壤含水率适宜，水分子在土粒周围形成水膜，切断或阻碍了石油烃与土壤颗粒间的联系、吸附，同时微生物可以进入水膜内，增加了与石油的接触机会，使微生物得以繁殖，能够在油水界面活跃生长，可高效降解石油烃。23%左右时，实验中观察到土壤已经成泥浆的状态，妨碍 O2的扩散，使好氧微生物缺氧而死亡，导致降解率较低[19]，仅为26.3%，与含水率为14%时的降解率28.4%相差不大。说明固定化微生物修复石油污染土壤时适宜的含水率应该维持在14%～23%之间，最好是18%左右。

图2 不同含水率下固定化微生物修复污染土壤的石油烃降解率随时间的变化

保持土壤适宜的水分有利于改善修复效果，特别是干旱或半干旱地区需要适时适量的补充水分，才能维持固定化微生物对石油烃的高效降解。

2.1.3 固定化微生物接种量的影响

初始含油率为4.72%的供试土壤，在不同接种量下，固定化微生物修复35 d，石油烃降解率随时间的变化如图3所示。

土壤中微生物是石油烃降解的动力与主体。从图3可以看出，不同微生物接种量的土壤中石油烃降解率变化规律基本一致，随着降解时间的延长，石油烃降解率也增加。修复35d，接种量为5%、10%、15%、20%的石油烃降解率分别为23.3%、39.4%、34.7%、26.4%，10%接种量的降解率最高。说明在一定范围内，接种量增多会提高降解率，超过此范围，接种量增多反而不利于石油烃的降解。

接种固定化微生物能够提高土壤的微生物数量，提高外接的石油降解菌与土著菌的竞争能力，使石油降解菌迅速适应环境，大量繁殖，发挥高效降解能力[20]。接种量与石油烃降解率并不是呈单一的正比例关系，当接种量过多，土壤营养物质不足，造成高效降解菌之间存在空间、营养上的竞争，导致降解率降低；另外，降解产生的代谢产物可能会降低微生物与石油烃的接触，也导致降解率降低。接种量过低，微生物数量与土著菌的竞争力不强，接入土壤中会有一部分微生物因为不适应而死亡，导致降解率很低，所以适宜的接种量对石油污染土壤修复具有重要的作用。本实验优选出最佳固定化微生物接种量为10%。

图3 不同接种量下固定化微生物修复污染土壤的石油烃降解率随时间的变化

在wC∶wN∶wP为100∶10∶1、含水率18%、接种量为10%的最佳条件下，固定化微生物修复35 d后，石油烃降解率达40.8%。

2.2 固定化微生物降解条件的响应面优化

2.2.1 响应面优化实验结果

根据单因素实验得出的结果,以wC/wN、含水率、接种量分别为自变量A、B、C，以35 d石油烃降解率为响应值Y，进行17个实验点(5个中心点)的响应面优化实验。响应面实验因素与水平设计表如表2所示。

表2 固定化微生物降解条件的响应面实验因素与水平

向17个相同的花盆中分别加入0.5 kg供试土壤，按照表3的实验安排，于30℃恒温箱内培养35 d。每天加水翻耕，保持充足的空气和水分，35 d后取土样测含油率，得出石油烃降解率。响应曲面各系数方差分析表列于表3。

当模型的模型显著系数“Prob>F”值小于0.05时，表示该项指标影响显著；小于0.01时，表示该项指标影响非常显著。失拟项表示模型的误差，失拟项系数为0.0937，大于0.05，表示模型在误差范围之内。

表3 本实验数据的二次响应面模型和方差分析

从表3可以看出，该模型的模型显著系数为<0.0001，表示非常显著；该模型的R2=0.9979，说明该模型的拟合度较好，精确度较高，可以用来分析和预测结果。从表3还看出，各一次项系数和二次项系数A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2的影响非常显著(“Prob>F” 值 小于0.01)，但是BC不显著(“Prob>F”值为0.2459，大于0.05)。对石油烃降解率影响的显著性从大到小依次是接种量、含水率、wC/wN。

以固定化微生物35d石油烃降解率为响应值，利用软件Design expert 8.06对Box-Behnken的实验结果进行二次多项回归拟合，各因素与响应值之间的关系可用二次多元回归方程表示，如式(1)所示。

Y=41.7+0.65A-0.87B+1.09C+0.96AB+

1.49AC-0.35BC-8.22A2-7.90B2-8.57C2

R2=0.9979(1)

式(1)中，Y为石油降解率的预测值，A、B、C分别是土壤的wC/wN、含水率以及固定化微生物接种量。

2.2.2 响应曲面图分析

根据等高线和三维图可以分析固定化微生物对石油污染土壤的石油烃降解率与各因素关系，并能够看出各因素存在的交互作用及最佳的降解条件，如图4所示。

从图4(a)可看出，随着wC/wN增大，固定化微生物对石油污染土壤的石油降解率先缓慢后快速增大，超过一定比值后快速减小，wC/wN为10左右时降解率最大；随含水率增大，石油降解率先快速增大后快速减小，含水率18%左右时降解率最大。

从图4(b)看出，随着wC/wN增大，固定化微生物对石油污染土壤的石油烃降解率缓慢增大后减小；随接种量增大，降解率先增大后减小。结合表4的方差分析，接种量对石油降解率的影响最大，如果在wC/wN充足时，适当添加外源菌有助于提高降解率。接种量在10%左右降解率最大。

从图4(c)看出，随着含水率增大，固定化微生物对石油污染土壤的石油烃降解率缓慢增大后减小；随接种量增大，降解率快速增大后减小，说明接种量对降解率的影响最大。如果在土壤水分充足条件下，接入外源菌能提高降解率。

图4 wC/wN和含水率、 wC/wN和接种量、含水率和接种量对污染土壤石油烃降解率相互作用的响应面

由此可见，wC/wN、含水率、接种量不是越大越利于石油烃的降解，它们对降解率的影响作用不同；3个因素存在显著的相互作用，存在最佳的组合，使得降解率达到最高。将二次多元回归方程求导，取降解率极大值点时的最佳实验参数，得到wC/wN=10.21、含水率17.8%、接种量10.34%，此时石油烃降解率的理论值达41.8%。

2.2.3 响应曲面模型验证

为了对模型的准确性进行验证，在上述实验条件下进行花盆模拟实验，于30℃的培养箱中修复35 d，得到石油烃降解率42.4%，与模型结果41.8%较接近，说明响应面优化法模型能很好地预测石油污染土壤的修复效果，比单因素实验得出最佳组合条件下的降解率大，但是相差不大。

3 结 论

(1)单因素实验得出，固定化微生物修复石油污染土壤的最佳条件为wC∶wN∶wP=100∶10∶1，含水率18%、接种量10%。任何一种因素过大或过小都会对石油烃降解不利。

(2)根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，通过响应面设计实验，建立了wC/wN、含水率、接种量与固定化微生物修复石油污染土壤的石油烃降解率之间关系的数学模型，该模型为Y=41.7+0.65A-0.87B+1.09C+0.96AB+1.49AC-0.35BC-8.22A2-7.90B2-8.57C2，R2=0.9979，模型回归效果显著。

(3)在含油率为4.72%时，响应面优化得到的固定化微生物修复石油污染土壤的最佳条件为wC∶wN∶wP=100∶9.79∶1，接种量10.34%、含水率17.8%。在此条件下，修复35 d得到的石油烃降解率为42.4%，比单因素实验得出的最佳组合条件下的结果高1.6%。对石油烃降解率影响的显著性从大到小的因素依次是接种量、含水率、wC/wN。

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Optimization for Petroleum-Contaminated Soil Remediated by Immobilized Microorganisms Using Response Surface Method

ZHANG Han，HAN Yutong，ZHANG Shoujuan，DING Zheng，ZHANG Xiuxia

(DepartmentofEnvironmentalandSafetyEngineering,ChinaUniversityofPetroleum,Qingdao266580,China)

Straw DG was used as carrier material for petroleum hydrocarbon degrading strain SJ5-1 to prepare immobilized microorganisms. In indoor flowerpot, the remediation of petroleum-contaminated soil by immobilized microorganisms was simulated, and the impacts ofwC∶wN∶wP, moisture content and the inoculum amount on hydrocarbon degradation rate were investigated by single factor experiment. Then the response surface method was used to design the experiment, by which a prediction model of quadratic polynomial regression equation was obtained to determine the optimal parameter arrangement. Under the optimized parameter arrangement, the model was verified. The results indicated that the model was proved veracious. By controlling the immobilized microorganisms inoculum being 10.34%,wC/wN=10.21, moisture content being 17.8% according to response surface analysis, the best degradation rate of 42.4% was obtained, which was higher than the best result of 40.8% obtained under the optimal conditions based on single factor experiment. The significance order of influence on hydrocarbon degradation rate from high to low was the inoculum amount, moisture content,wC/wN.

immobilized microorganisms; petroleum-contaminated soil; response surface method; optimum condition

2014-03-03

山东省自然科学基金(ZR2014BM023)、中国石油科技创新基金(2009D-5006-07-01)、青岛市科技发展指导计划项目(KJZD-12-65-jch)、中央直属高校科研专项基金(11CX05011A)、中国石油大学(华东)研究生创新工程(CX-1219)和(CX2013035)资助

张涵，女，硕士，主要研究石油污染土壤修复；E-mail:zhanghan 199101@163.com

张秀霞，女，教授，博士，主要从事石油污染土壤修复研究 ；E-mail:zhxiuxia@upc.edu.cn

1001-8719(2015)04-1028-07

X53

A

10.3969/j.issn.1001-8719.2015.04.029