鸦葱总黄酮抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

谢扬，王静，耿艳梅，曲妍霏，张志，王广树

(吉林大学 药学院，吉林 长春 130021)



鸦葱总黄酮抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

谢扬，王静，耿艳梅，曲妍霏，张志，王广树Δ

(吉林大学 药学院，吉林 长春 130021)

目的 探讨鸦葱总黄酮对乙型肝炎病毒的体外抑制作用。方法 通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞的影响；采用酶联免疫吸咐(ELISA)法检测分析鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞分泌表面抗原(HBsAg)和E抗原(HBeAg)的抑制作用；采用荧光定量PCR法检测鸦葱总黄酮对乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)的影响。结果 鸦葱总黄酮对 HepG2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)为0.603 mg/mL；鸦葱总黄酮高中低3个无毒剂量(0.062、0.125、0.250 mg/mL)均能明显降低HepG2.2.15细胞培养液中HBsAg、HBeAg的含量和HBV-DNA数量，最大抑制率分别为89%、33%及43%。结论 鸦葱总黄酮具有显著的抗乙型肝炎病毒作用。

鸦葱；黄酮；乙型肝炎病毒

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的一种严重危害人类健康及生命安全的常见重大疾病。其发病率高，病程长，自身免疫系统发生紊乱，部分患者最终发展为肝硬化、肝癌，且预后极差[1-3]。全世界有3.5～4.0亿乙型肝炎病毒感染者[4]，其中，每年有近100万患者死于HBV感染引起的肝硬化和肝癌[5-6]。在我国有1.2亿多HBV感染者，约占全球感染总数的1/3，居世界首位，其中慢性乙型肝炎患者3000万例，我国每年有近30万患者死于因乙肝诱发的相关疾病[7-10]。乙肝给患者家庭、社会造成沉重的经济负担，引发一系列社会问题，是我国现阶段最为突出的公共卫生问题之一。因此，寻找和研究既具有抗病毒又具有保肝作用的有效天然药物，对慢性乙肝的治疗具有十分重要的临床意义。前期本研究课题组已证实了鸦葱总黄酮的保肝作用[11]。本实验旨在通过体外抑制HBV药物筛选体系HepG2.2.15细胞，观察鸦葱总黄酮对细胞分泌HbsAg、 HbeAg和HBV DNA的影响，探讨鸦葱总黄酮的抗乙肝病毒作用，为鸦葱总黄酮的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验原料：鸦葱药材采自于吉林省四平地区，经吉林大学药学院生药教研室张静敏教授鉴定为鸦葱ScorzoneraaustriacaWild。

1.1.2 细胞株：HepG2.2.15细胞株，复旦大学附属肿瘤医院提供。

1.1.3 主要药品及试剂：D101型大孔树脂、D4020型大孔树脂(天津农药股份有限公司树脂分公司)；四季青胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)；高糖DMEM培养液(Gibco USA)；G418、MTT(Sigma公司)；双抗(青链霉素，Hyclone公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；HBsAg ELISA检测试剂盒、HbeAg ELISA检测试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)；乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(上海浩源生物科技有限公司)。

1.1.4 实验仪器：TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂)；DNM-9602酶标仪(北京普朗有限公司)；二氧化碳培养箱、无菌超净台(上海新苗医疗器械制造有限公司)；37XB倒置显微镜(上海光学仪器五厂)；ABI 7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；EZbead System-32核酸提取仪(Texas Biogene，Inc.)。

1. 2 方法

1.2.1 鸦葱总黄酮(total flavonoids inScorzoneraaustriacaWild，TFSA)的制备[11]：鸦葱全草，用70%的乙醇浸泡，减压回收乙醇，然后上D-101大孔树脂色谱柱，用水、60%的乙醇溶液洗脱，收集60%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，干燥，得鸦葱粗制黄酮提取物。将粗制总黄酮上样到D4020大孔树脂色谱柱上，依次用水、5%乙醇、10%乙醇、30%乙醇洗脱，薄层色谱板检测，收集含有黄酮部分的洗脱液，减压浓缩，干燥，得到精制鸦葱总黄酮。

1.2.2 鸦葱总黄酮的细胞毒性实验：用胰酶消化HepG2.2.15细胞，轻轻吹打分散成单个细胞悬液，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成细胞浓度为5×105个/mL的细胞悬液，按每孔0.1 mL分种于96孔板，置37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养，待细胞长成单层后每孔加含不同浓度鸦葱总黄酮培养维持液0.1 mL，每个浓度6孔。鸦葱总黄酮实验原液以含10%胎牛血清、380 μg/mL G418的DMEM培养液作系列倍比稀释，配制成1.000、0.500、0.250、0.125、0.062 mg/mL 5个浓度鸦葱总黄酮培养维持液。另设细胞对照组，每孔加0.1mL不含药液的细胞培养液。将96孔板置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内继续培养，连续培养3d后，轻轻吸除培养细胞上清液，按Sargent JM等[12]建立的MTT法测定鸦葱总黄酮对细胞生长的半数毒性浓度(TC50)：向前述细胞加入400 μg/mL MTT 0.1 mL/孔，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内孵育4 h，再每孔加入100% DMSO 0.1 mL，37 ℃、5%CO2培养箱内密闭孵育约10 min后，用酶标仪在490 nm波长测定各孔OD值。TC50细胞破坏率(%)=(细胞对照组平均OD值-给药实验组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值-空白对照组OD值)×100%。按照Reed-Meuench法[13]计算药物的TC50=Antilog[B+(50%-<50%破坏率)/(>50%-<50%破坏率)×C]；A=log>50%药物浓度，B=log<50%药物浓度，C=A-B。

1.2.3 培养细胞上清液中HbsAg、HbeAg、HBV-DNA的检测：按照1.2.2项下，将HepG2.2.15细胞接种于96孔板中，分为5个组，细胞对照组、低剂量鸦葱总黄酮组(0.062 mg/mL)、中剂量鸦葱总黄酮组(0.125 mg/mL)、高剂量鸦葱总黄酮组(0.250 mg/mL)、拉米夫定阳性药组(0.1 mg/mL)。每3 d更换一次培养液，同时收集各组3、6、9 d后培养板中细胞上清液。按照 ELISA试剂盒检测说明书操作，酶标仪读取各组OD450值，计算鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg、HBeAg的抗原表达抑制率。按乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒说明书操作，采用荧光定量PCR的方法检测各组病毒数量，计算鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞培养液中3、6、9d的HBV-DNA病毒抑制率。

2 结果

2.1 鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞的毒性作用 MTT染色法结果显示：在0.250 mg/mL及以下浓度下对HepG2.2.15细胞无毒性作用。鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞的TC50为0.603 mg/mL。见表1。

2.2 鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞上清培养液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的影响 ELISA结果显示：0.250 mg/ mL鸦葱总黄酮处理HepG2.2.15细胞9 d，对HBsAg的抑制率为89%，处理HepG2.2.15细胞bd对HBeAg的抑制率为33%。见表2、表3。荧光定量PCR结果显示：0.125 mg/mL鸦葱总黄酮处理HepG2.2H15细胞3 d对HBV-DNA的抑制率为43%。见表4。

表2 鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用Tab.2 Inhibitory effect of TFSA on HBsAg secreted by HepG2.2.15 ±s，n=6)

*P<0. 01，与对照组比较，compared with control group

表3 鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制作用Tab.3 Inhibitory effect of TFSA on HBeAg secreted by HepG2.2.15 ±s，n=6)

*P<0. 01，与对照组比较，compared with control group

表4 鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞分泌HBV-DNA的抑制作用Tab.4 Inhibitory effect of TFSA on HBV-DNA secreted by HepG2.2.15 ±s，n=6)

*P<0. 01，与对照组比较，compared with control group

3 讨论

HepG2.2.15细胞株系以重组载体pDolTHBV-1(含2个HBV头对尾二聚体，以尾对尾方向串联)转染人肝癌细胞株HepG2，经G418筛选后获得的一个表达高水平HBsAg、HBeAg的细胞克隆[14]，由美国The Mount Sinai Medical Center 于1986年建立[16]，并且已成功地应用于抗HBV药物的筛选[16-17]，作为抗HBV作用的指标，被中国卫生部收载于治疗肝炎的《中药新药药效学研究指南》[18]。乙型肝炎感染的血清标志物包括HBV DNA、HBsAg、HBeAg, 特别是HBV DNA水平的监测已成为抗HBV治疗的评价标准[19]。因此，本实验选用HepG2.2.15细胞作为细胞模型，以HBV DNA、HBsAg、HBeAg为指标，研究鸦葱总黄酮的抗乙肝病毒作用。

本实验首先通过MTT染色法，检测鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞的毒性作用，结果发现TC50为0.603 mg/mL，在0.250 mg/mL及以下浓度下对HepG2.2.15细胞没有毒性作用。然后在无毒浓度下进行药物干预培养。利用HBsAg、HBeAg ELISA试剂盒，检测鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HbeAg的抑制作用。结果表明，鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg有显著的抑制作用(P<0.01)，且抑制率随着鸦葱总黄酮浓度的升高而增大，呈良好的剂量依赖关系。荧光定量PCR法结果表明，鸦葱总黄酮对HepG2.2.15细胞上清培养液中HBV-DNA的含量有显著降低体用(P<0.01)，其中0.125 mg/mL浓度的鸦葱总黄酮干预细胞培养第3天后抑制率最大，达到43%，说明鸦葱总黄酮具有抗乙肝病毒作用。因此鸦葱总黄酮有望成为治疗慢性乙型肝炎候选药物。本研究为开发抗乙肝病毒药物提供了实验基础。

[1] 吴迪，宁琴．2014年慢性病毒性肝炎临床诊疗进展[J]．实用肝脏病杂志，2015，18(1)：10-14.

[2] 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会．慢性乙型肝炎防止指南(2010年版)[J]．中华肝脏病杂志，2011，19(1)：13-24.

[3] Lok AS.Hepatitis:long-term therapy of chronic hepatitis B reverses cirrhosis[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2013,10(4):199-200.

[4] Zheng X,Wang JZ,Yang DL.Antiviral therapy for chronic hepatitis B in China[J].Med Microbiol Immunol,2015,204(1):115-120.

[5] Cui FQ,Liang XF,Gong XH,et al.Preventing hepatitis B though universal vaccination:Reduction of inequalities through the GAVI China project[J].Vaccine,2013,31(S9):J29-J35.

[6] Lozano R,Naghavi M,Foreman K,et al.Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010[J].Lancet,2012,380(9859):2095-2128.

[7] 徐巍，苏乐群，李宏建．乙肝治疗药物的研究进展及临床评价[J]．中国医院药学杂志，2008，28(9)：737-739.

[8] Wang FS,Fan JG,Zhang Z,et al.The Global Burden of Liver Disease:The Major Impact of China[J].Hepatology,2014,60(6):2099-2108.

[9] Howell J,Van Gemert C,Lemoine M,et al.An overview of hepatitis B prevalence,prevention,and management in the Pacific Islands and Territories[J].J Gastroenterol Hepatol,2014,29(11):1854-1866.

[10] Sui M,Wu R,Hu X,et al.Low prevalence of hepatitis B virus infection in patients with autoimmune diseases in a Chinese patient population[J].J Viral Hepat,2014,21(12):625-929.

[11] 张天文，谢扬，张志，等.鸦葱总黄酮保肝作用的体内外研究[J].中国生化药物杂志，2015，35(5)：6-9,13.

[12] Sargent JM,Tlaylor CG.Appraisal of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid leukemia[J].Br J Cancer,1989,60(2):206-210.

[13] 蒋美娟，李玉虎.中药单方乙醇提取液抗乙肝病毒的实验研究[J].医学信息，2011，24(8)：4910-4912.

[14] 郑浩杰.利用2.2.15细胞株筛选抗乙肝病毒中草药的体外实验研究进展[J].陕西中医学院学报，2003，26(2)：61-63.

[15] Sells MA,Chen ML,Acs G.Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:1005-1009.

[16] 雷小英，闫永平，徐德忠，等.HBV转基因小鼠孕前期及孕期应用乙肝疫苗的实验研究[J].第四军医大学学报，2003，24(24)：2293-296.

[17] Halverscheid L,Mannes NK,Weth R,et al. Transgenic mice replicating hepatitis B virus but lacking expression of the major HBsAg[J].J Med Virol,2008,80(4):583-590.

[18] 中华人民共和国卫生部药政管理局．中药新药研究指南[S].北京：1994：82.

[19] Lee SJ,Lee HK,Jung MK,et al.In vitro Antiviral Activity of 1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-β-D-glucose against Hepatitis B Virus[J].Bid Pharm Bull,2006,29(10):2131-2134.

(编校：吴茜)

Experimental studies on inhibitory effects of total flavonoids inScorzoneraaustriacawild on hepatitis B virus in vitro

XIE Yang, WANG Jing, GENG Yan-mei, QU Yan-fei, ZHANG Zhi, WANG Guang-shuΔ

(School of Pharmaceutical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo investigate anti-HBV effect of total flavonoids inScorzoneraaustriacawild (TFSA) in vitro.MethodsMTT assay was used to observe the effect of TFSA on HepG2.2.15 cells，ELISA assay was used to detect the inhibition on HBsAg and HBeAg secretion from HepG2.2.15 cells and RTFQ-PCR assay was used to detect the inhibition rates of HBV-DNA.ResultsThe TC50of TFSA on HepG2.2.15 cells was 0.603 mg/mL. TFSA significantly reduced the content of HBsAg and HBeAg and the numbers of HBV-DNA in the HepG2.2.15 cell cultural supernatants under nontoxic concentrations (0.062, 0.125, 0.250 mg/mL), and the maximal inhibitory rate was 89%, 33% and 43%, respectively.ConclusionTFSA have anti-HBV effects in vitro.

Scorzoneraaustriacawild; flavonoids; hepatitis B virus

国家科技重大专项重大新药创制(2013ZX09103002-007)

谢扬，女，硕士，研究方向：中草药有效成分的研究，E-mail：13514486691@163.com；王广树，通讯作者，男，博士、教授、博士生导师，研究方向：中草药有效成分的研究，E-mail：wgs@jlu.edu.cn。

R944.9

A

1005-1678(2015)08-0041-04