银杏叶提取物对帕金森患者血清黑质DMT1、葡萄糖调节蛋白75及神经功能的影响研究

卫飞，帅杰，申林，龚自力，程赛宇

(第三军医大学第二附属医院 神经内科，重庆 400000)



银杏叶提取物对帕金森患者血清黑质DMT1、葡萄糖调节蛋白75及神经功能的影响研究

卫飞，帅杰，申林，龚自力，程赛宇

(第三军医大学第二附属医院 神经内科，重庆 400000)

目的 探讨银杏叶提取物对帕金森患者血清黑质二价金属离子转运蛋白(divalent metal transporter1，DMT1)、葡萄糖调节蛋白75(glucose regulated protein 75，grp75)及神经功能的影响。方法 帕金森患者38例，根据用药不同分为对照组和实验组，每组各19例，对照组患者给予多巴丝肼片，实验组在对照组的基础上给予银杏叶提取物片，治疗连续4周。治疗结束后，对所有患者黑质DMT1、grp75及认知功能进行检测。结果 与治疗前相比，治疗后2组患者的黑质DMT1水平较低(P<0.05)；与对照组相比，实验组患者治疗后黑质DMT1水平较低(P<0.05)。与治疗前相比，治疗后2组患者的grp75水平较高(P<0.05)，与对照组相比，实验组患者治疗后grp75水平较高(P<0.05)。与治疗前相比，治疗后2组患者的MoCA评分较高(P<0.05)，HAMD评分较低(P<0.05)；与对照组相比，实验组患者治疗后MoCA评分较高(P<0.05)，HAMD评分较低(P<0.05)。结论 银杏叶提取物能够显著降低帕金森患者黑质DMT1水平，升高grp75水平，改善认知功能。

银杏叶提取物；帕金森病；黑质DMT1；葡萄糖调节蛋白75；神经功能

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，是锥体外系功能紊乱引起的一种慢性中枢神经系统退行性疾病，多发于中老年人并严重影响其生活质量。目前该病的病因尚不明确，得到大多数学者公认的是多巴胺缺失学说[1]。美国约有100万患者饱受震颤之苦，其中50万人有帕金森病，我国发病人数约200万，发病率高达l%以上[2]。除了运动功能障碍，大多数帕金森病患者都容易合并抑郁、情感淡漠、焦虑、认知功能障碍等非运动症状[3]。此外认知功能障碍、自主神经紊乱、精神异常等多种非运动症状是PD常见的并发症[4]，约有2/5的患者会发展成痴呆，约为健康成人的6倍，严重影响患者的生存质量。临床常用药物有多巴胺，左旋多巴等，但其副作用较大，用药不合理容易导致椎体外系综合征。

银杏叶为银杏的干燥叶，在我国有悠久的药用历史，广泛被药学研究者研究、开发与利用。银杏叶化学成分复杂，其发挥独特药理活性的主要有效成分为其所含的黄酮类、聚异戊烯醇类等化合物。研究显示[5]，银杏叶提取物EGb761具有多种生理活性，除对心血管系统具有明显的保护作用外，在神经系统疾病治疗中也有明显疗效，如改善脑和外周神经系统的血液供应，保护神经细胞免受损伤，改善神经退行性病变和衰老引起的认知能力的下降等作用。本研究通过观察银杏叶提取物对帕金森患者血清黑质DMT1、葡萄糖调节蛋白75及神经功能的影响，探究银杏叶提取物对帕金森患者的疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集本院神经内科2014年1月～2015年3月收治的帕金森住院患者38例，随机分为实验组和对照组。其中实验组19例，组内男性8例，女性11例，平均年龄(62.21±8.45)岁；对照组19例，男性10例，女性9例，平均年龄(63.35±8.39)岁。本试验获得我院伦理委员会批准，并且全程进行跟踪随访监督。

所有患者均符合第五届全国帕金森病和运动障碍疾病学术研讨会2006[6]：帕金森病的诊断主要依靠病史、临床症状及体征。根据隐袭起病、逐渐进展的特点，单侧受累进而发展至对侧，表现为静止性震颤和行动迟缓，排除非典型帕金森病样症状即可作出临床诊断。对左旋多巴制剂治疗有效则更加支持诊断。常规血、脑脊液检查多无异常；头CT、MRI也无特征性改变；嗅觉检查多可发现PD患者存在嗅觉减退；以18F-多巴作为示踪剂行多巴摄取功能PET显像可显示多巴胺递质合成减少；以125I-β-CIT、99mTc-TRODAT-1作为示踪剂行多巴胺转运体(DAT)功能显像可显示DAT数量减少，在疾病早期甚至亚临床期即可显示降低，可支持诊断。

1.2 纳入标准 所有入选患者均符合帕金森的诊断标准，经多巴胺类药物治疗有效，所有患者年龄在50～79岁之间，性别不限；患者意识清楚，能够配合实验措施。所有患者同意进行实验措施，并签署知情同意书。

1.3 排除标准 排除脑血管疾病、脑炎及外伤等原因引起的帕金森综合征的患者；排除肝肾功能不全及心血管疾病的患者；排除高血压及糖尿病患者；排除伴有认知功能严重障碍影响实验进行的患者；排除不同意进行试验措施的患者。

1.4 方法

1.4.1 治疗方法：按照临床用药指南，2组患者均给予物理治疗和功能锻炼等基础治疗。对照组患者给予多巴丝肼片(上海罗氏制药有限公司，国药准字H10930198)，初始剂量62.5 mg，1次/天，5 d后，每次125 mg，2次/天，口服，此后为500 mg/d，3次/天，口服，一般在餐前或餐后1 h服用；实验组在对照组的基础上给予银杏叶提取物片(Extract of Ginkgo Biloba Leaves Tablets，注册证号：H20090296)，2片/次，3次/天，口服，治疗连续4周。

1.4.2 患者黑质DMT1水平及葡萄糖调节蛋白75(glucose regulated protein 75，grp75)水平检测：治疗前后取患者清晨空腹血10 mL，置于抗凝管中备用。采用双抗体夹心法检测患者黑质DMT1水平及葡萄糖调节蛋白75(grp75)水平。将患者血液分成2份，2000 r/min离心30 min，取上清。将上清分别置于免疫实验微孔板中，再分次向微孔中加入黑质DMT1还原酶与葡萄糖调节蛋白75还原酶，加入辣根过氧化物酶(HRP)，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，最后加底物3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)显色。显色后，TMB在HRP酶的催化下发生连续的颜色转化，最后变为黄色。由于颜色深浅与标本血清中的黑质DMT1水平及葡萄糖调节蛋白75(grp75)水平呈正比例关系，用M600全自动酶标仪(上海研卉生物科技有限公司)测定标本的吸光度(OD值)，最终可得出黑质DMT1及葡萄糖调节蛋白75(grp75)浓度。具体操作步骤参照试剂盒(上海宝曼生物科技有限公司)说明书进行。

1.4.3 患者认知功能评定：所有患者采用蒙特利尔认知评估量表(MoCA)[7]以及汉密尔顿抑郁量表(HAMD)[8]对神经功能进行检测，蒙特利尔认知评估量表包括12道题，包括注意力、语言能力、延迟回忆、命名能力、抽象能力、定向力、空间与执行功能。总分为30分，得分越高表明认知功能越好。患者受教育年限≤12年者，测试结果加1分。26分以上为认知功能良好。汉密尔顿抑郁量表包括焦虑/躯体化、认知障碍、日夜变化、睡眠障碍等方面组成。结果判定标准：总分>35分为严重抑郁，21～35分之间为轻中度抑郁，8～20分之间为临界抑郁，<8分为无抑郁。

2 结果

2.1 患者一般情况比较 实验组与对照组患者在男女比例，年龄，病程以及受教育年限资料差异无统计学意义。见表1。

表1 2组患者一般情况表±s)Tab.1 Comparison of the baseline between two ±s)

2.2 治疗前后2组患者黑质DMT1水平比较 与治疗前相比，治疗后2组患者的黑质DMT1水平较低(P<0.05)；与对照组相比，实验组患者治疗后黑质DMT1水平较低(P<0.05)。见表2。

表2 治疗前后2组患者黑质DMT1水平比较Tab.2 Comparison of the DMTI levels between two ±s，μmol/L)

*P<0.05，与治疗前相比，compared with pre-treatment；#P<0.05，与对照组治疗后相比，compared with control group post-treatment

2.3 治疗前后2组患者grp75水平比较 与治疗前相比，治疗后2组患者的grp75水平较高(P<0.05)，与对照组相比，实验组患者治疗后grp75水平较高(P<0.05)。见表3。

表3 治疗前后2组患者grp75水平比较Tab.3 Comparison of the grp75 levels between two ±s，μmol/L)

*P<0.05，与治疗前相比，compared with pre-treatment；#P<0.05，与对照组治疗后相比，compared with control group post-treatment

2.4 治疗前后2组患者认知功能比较 与治疗前相比，治疗后2组患者的MoCA评分较高(P<0.05)，HAMD评分较低(P<0.05)；与对照组相比，实验组治疗后MoCA评分较高(P<0.05)，HAMD评分较低(P<0.05)。见表4。

表4 治疗前后2组患者认知功能评分比较±s，分)Tab.4 Comparison of the cognitive functions between two ±s，score)

*P<0.05，与治疗前相比，compared with pre-treatment；#P<0.05，与对照组相比，compared with control group

3 讨论

据资料显示，我国有超过500万的帕金森病患者，55岁以上的人群中帕金森患病率约为1%，随着年龄的增长，帕金森的患病率也逐渐升高[9]。随着世界人口老龄化日趋严重，帕金森综合征的患病率也逐年升高。帕金森病主要表现除运动障碍之外，还伴有焦虑、抑郁、认知功能障碍、精神异常等多种非运动症状。其最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡。

本研究表明，治疗后2组患者的黑质DMT1水平均显著下降(P<0.05)；治疗后，与对照组相比，实验组患者的黑质DMT1水平下降较为明显(P<0.05)。研究显示[10]，帕金森病是由于中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡与过渡金属铁的关系密切。帕金森病患者脑内铁的含量显著升高，升高的主要部位是黑质和苍白球，其升高程度与帕金森病的严重程度相关。近年来，采用经颅超声方法检测到帕金森病患者黑质部回声增强，这可能与该部位铁含量的升高有关。铁代谢有赖于各种相关蛋白的调节。帕金森病患者中，许多与铁代谢有关的蛋白表达出现异常，如CP、DMT1等。DMT1是一种跨膜的铁转出蛋白。研究表明[11]，在帕金森患者黑质神经元细胞中，DMT1有中度高表达，并且与铁升高的部位相同，表明其可能是导致铁含量升高的原因。DMT1作为金属离子转运体，可能是脑内铁离子紊乱的原因之一。本研究治疗后DMT1水平显著下降(P<0.05)，表明本实验措施能够通过减少脑内DMT1水平达到使脑内铁含量下降的目的。

分子伴侣(molecular chaperones)是一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，能够参与蛋白质的变构、转运及降解，对蛋白质的正确折叠，保护新生蛋白质的伸展状态具有促进作用。能够保护细胞免受损伤。葡萄糖调节蛋白75是一种主要存在于细胞线粒体中的热休克蛋白(heat shock protein，HSP)。它行使分子伴侣的功能，协助细胞质中合成的线粒体蛋白肽链转运入线粒体，帮助肽链在线粒体中正确折叠和装配，介导异常蛋白质的降解[12]。本研究表明，治疗后2组患者的grp75水平均显著上升(P<0.05)，实验组患者的grp75水平上升较明显(P<0.05)。近年来的研究证实，grp75与帕金森病密切相关。帕金森病患者黑质线粒体中grp75的表达显著降低，且帕金森病患者grp75的基因突变能够显著影响线粒体功能[13]。本实验结果表明，银杏叶提取物能够显著升高患者脑内grp75水平，对帕金森病具有较好的治疗作用。

本研究通过探究银杏叶提取物对帕金森患者黑质DMT1、grp75水平，认知功能的影响，证实了银杏叶提取物能够显著降低帕金森患者黑质DMT1水平，升高grp75水平，改善认知功能。本实验得出的结论及反映的现象将在下一步研究中深入论证。

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[2] 姜焕芹，赵玉芝.立体定向治疗帕金森病的护理[J].吉林医学，2008，29(8):688.

[3] 张献文，曾文双，邓远飞.帕金森病并发抑郁的研究进展[J].卒中与神经疾病，2013，20(5)：62-64.

[4] 余舒扬，张巍.帕金森病认知障碍的异质性[J].中华神经科杂志，2012，45(6)：241-244.

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(编校：谭玲)

Effect of Ginkgo biloba extract on serum DMT1, grp75 and neurological function in patients with Parkinson disease

WEI Fei, SHUAI Jie, SHEN Lin, GONG Zi-li, CHENG Sai-yu

(Department of Neurology, The Second Affiliated Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of Ginkgo biloba extract on serum divalent metal transporter1(DMT1), glucose regulated protein 75(grp75) and nerve function in patients with Parkinson disease.Methods38 cases of patients loith parkinson disease according to different drugs were divided into experimental group and control group, 19 cases in each group.Control group was treated with levodopa and Benserazide tablet, experimental group on the basis of control group, was given Ginkgo biloba extract tablets, treatment for 4 weeks. After treatment, DMT1, grp75 and cognitive function of all patients in substantia nigra were detected.ResultsCompared with before treatment, two groups of patients with lower DMT1 level (P<0.05), compared with control group, experimental group of patients with lower DMT1 levels (P<0.05). Compared with pre-treatment, two groups of patients grp75 level was higher (P<0.05), compared with control group, experimental group after treatment grp75 level was higher (P<0.05). Compared with before treatment, the two groups of patients with MoCA scores were higher (P<0.05), HAMD scores were lower (P<0.05).Compared with control group, experimental group after treatment MoCA scores were higher (P<0.05), HAMD scores were lower (P<0.05).ConclusionGinkgo biloba extract can significantly reduce the level of DMT1 in the substantia nigra of Parkinson patients, increase the level of grp75, and improve the cognitive function.

Ginkgo biloba extract; Parkinson disease; substantia nigra DMT1; glucose regulated protein 75; nerve function

卫飞，男，博士，主治医师，研究方向：神经病学，E-mail：sdfghjk8kio@sina.com。

R741

A

1005-1678(2015)08-0072-03