HPLC法测定小儿复方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸含量

陈宇，梁蔚阳

(广东省食品药品检验所，广东 广州 510180)



HPLC法测定小儿复方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸含量

(广东省食品药品检验所，广东 广州 510180)

目的 建立测定小儿复方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸含量的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)。方法 采用Agilent 1200型高效液相色谱仪，使用Agilent Hypersil ODS色谱柱(250 mm×4.0 mm，5 μm)，以20 mmol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值至2.5)-乙腈(90:10)为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长210 nm，柱温25 ℃。结果 乙酰酪氨酸峰与其他氨基酸色谱峰分离度良好，乙酰酪氨酸在12.062～120.62 μg/mL范围内呈良好的线性关系(r=0.9999)，平均加样回收率(n=9)为100.0%，RSD%(n=9)为0.9，其定量限(S/N=10)为0.15 μg/mL。结论 建立的HPLC法可用于小儿复方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸的质量控制。

乙酰酪氨酸；小儿复方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)； HPLC

小儿复方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)是由19种氨基酸配制而成的灭菌水溶液，主要治疗早产儿、低体重儿及各种病因所致不能经口摄入蛋白质或摄入量不足的新生儿和因烧伤、外伤及手术等高代谢状态的小儿[1]。最近临床上还将其与叶酸片、葡萄糖酸锌或小剂量654-2片联合用药，用于治疗小儿轮状病毒感染性肠炎、迁延性腹泻等疾病[2-5]。小儿复方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)原为北京制药厂研发生产，现行质量标准收载于国家药品标准新药转正标准第48册WS1-(X-507)-2003Z，其酪氨酸的处方量为1.4 mg/mL[6]。但酪氨酸在水中溶解度极低，约为0.5 mg/mL。经过模拟处方试验发现如按标准处方量投料生产，样品有大量结晶析出，说明其处方存在问题[7]。小儿复方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)的质量标准中采用紫外分光光度法测定酪氨酸含量，该方法专属性低，无法准确测得样品中酪氨酸的量。

在前期的实验中，分别采用Waters AccQ-Tag法和Agilent OPA/FMOC法测定样品中酪氨酸的含量，约为0.4 mg/mL[8-9]。上述2种方法的原理是利用衍生物与氨基酸的伯胺基或仲胺基发生反应，生成具有荧光或紫外吸收的物质，从而通过色谱分离测得吸收值[10]。根据以上实验分析，样品中含有的物质可能为分子结构中带有芳香环和叔胺基的乙酰酪氨酸。

本文拟通过HPLC法对乙酰酪氨酸与其他氨基酸进行有效分离，考察小儿复方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)是否含有乙酰酪氨酸，并对其含量进行方法学验证。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 酪氨酸、苯丙氨酸、乙酰酪氨酸、色氨酸(中国食品药品检定研究院，批号分别为：140609-201212、140676-200405、140672-200501、140686-201303)。生产企业A，样品1批(批号：Y1211222)；生产企业B，样品3批(批号：20130401，20130402，20130403)；生产企业C，样品1批(批号：C13013104)。磷酸二氢钠与磷酸(分析纯，广州化学试剂厂)；乙腈(色谱纯，Merck)；超纯水。

1.2 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪、Agilent Hypersil ODS(250 mm×4.0 mm，5 μm)(美国Agilent公司)；Waters 2695/2487高效液相色谱仪、Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱(美国Waters公司)；Millipore超纯水发生仪(美国Millipore公司)；Sartorius PB-10 pH计(德国Sartorius公司)。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件：色谱柱：Agilent Hypersil ODS(250 mm×4.0 mm，5 μm)；流动相：20 mmol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值至2.5)-乙腈(90:10)；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：210 nm；进样量：10 μL。

1.3.2 溶液的制备

① 系统适用性溶液:取酪氨酸、苯丙氨酸、乙酰酪氨酸和色氨酸对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每 1 mL 中约含酪氨酸16 μg、苯丙氨酸116 μg、乙酰酪氨酸48 μg和色氨酸48 μg的混合溶液，即得。

② 对照品溶液:精密称取乙酰酪氨酸适量，用流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含48 μg的溶液，即得。

③ 供试品溶液:精密量取本品适量，用流动相稀释制成每1 mL中约含乙酰酪氨酸48 μg的溶液，即得。

1.3.3 系统适用性试验:取“1.3.2”项下的①溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

1.3.4 线性试验：精密称取乙酰酪氨酸对照品适量，用流动相溶解并定量稀释制成含乙酰酪氨酸12.062～120.62 μg/mL的溶液，参照“1.3.1”项下的色谱条件，进样测定。

1.3.5 定量限与检测限：取“1.3.2”项下的②对照品溶液逐级定量稀释，进样并记录色谱图，按信噪比(S/N)分别为10和3计算定量限和检测限。

1.3.6 精密度试验：精密量取“1.3.2”项下的对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录色谱图，计算峰面积。

1.3.7 重复性试验：取生产企业B(批号：20130401)的样品，参照“1.3.2”项下③的方法配制供试品溶液6份，按“1.3.1”项下方法进样。

1.3.8 加样回收率试验：取乙酰酪氨酸对照品分别用流动相溶解并稀释至成浓度为0.96、1.2、1.44 mg/mL的贮备液，精密量取上述溶液1 mL，分别置50 mL量瓶中，加入同批号样品(生产企业A，批号为20130401，乙酰酪氨酸为1.2 mg/mL)1 mL，按“1.3.1”项下的方法配制加样回收率溶液，各进样10 μL，记录色谱图。

1.4 样品测定 参照“1.3.2”项下的方法配制对照品溶液与供试品溶液，参照“1.3.1”项下的色谱条件进样，按外标法以峰面积计算乙酰酪氨酸的含量。

1.5 耐用性试验 除高效液相色谱仪为Waters 2695/2487检测器，色谱柱为Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)外，其他按“1.3.1”项下的色谱条件进样，按外标法以峰面积计算乙酰酪氨酸的含量。

1.6 结果比较 参考小儿复方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)的质量标准WS1-(X-507)-2003Z，采用紫外分光光度法对5批样品的酪氨酸含量进行测定，与采用Waters AccQ-Tag和HPLC法测得酪氨酸与乙酰酪氨酸的量进行比较。

2 结果

2.1 系统适用性试验 乙酰酪氨酸的保留时间约为5.8 min，乙酰酪氨酸峰与苯丙氨酸峰、乙酰酪氨酸峰与色氨酸峰的分离度均为6.6，理论板数按乙酰酪氨酸峰计为12107，见图1。

图1 系统适用性试验图谱Fig.1 Chromatogram of system suitability solution

2.2 线性试验 以进样浓度(X,μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为Y=11.38X-1.092，相关系数为0.9999。结果表明，乙酰酪氨酸在上述浓度范围内线性关系良好。

2.3 定量限和检测限试验 乙酰酪氨酸的定量限为0.15 μg/mL，检测限为0.05 μg/mL。

2.4 精密度试验和重复性试验 精密度试验测定其峰面积的RSD(n=6)为0.1%。表明仪器的精密度良好。重复性试验表明乙酰酪氨酸峰面积的RSD(n=6)为0.5%。

2.5 加样回收率试验 乙酰酪氨酸的加样回收率为100.0%，RSD值为0.9%。结果表明，该方法有良好的回收率。

2.6 样品测定结果 样品测定结果及耐用性试验结果见表1，图2。

表1 样品测定结果及耐用性试验结果Tab.1 Determination and robustness results of samples

图2 供试品溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of the sample

2.7 不同测定方法的结果比较 不同方法测定酪氨酸与乙酰酪氨酸的含量比较，见表2。

表2 结果比较Tab.2 Comparison of results

3 讨论

大多数高效液相色谱法测定氨基酸含量的原理是利用衍生物与氨基酸的伯胺基或仲胺基发生化学反应，生成具有荧光或紫外吸收的物质，从而通过色谱分离测得吸收值。采用Waters AccQ-Tag方法对以上5批样品进行氨基酸含量分析，其酪氨酸含量均约为0.4 mg/mL，低于酪氨酸处方量(1.4 mg/mL)，说明可能存在生产企业未按申报的工艺进行生产的情况。5批样品中乙酰酪氨酸的量(以酪氨酸计)与酪氨酸的量之和约为1.4 mg/mL，与其处方量接近，说明处方中酪氨酸的量是乙酰酪氨酸与酪氨酸的含量之和。

小儿复方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)的现行标准规定，采用紫外分光光度法测定酪氨酸的量，其专属性差，不能有效分离酪氨酸与乙酰酪氨酸。采用高效液相色谱法对小儿复方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸的量进行测定，能有效控制其质量。

在试验过程中使用Waters Symmetry C18与Agilent Hypersil ODS色谱柱时发现，乙酰酪氨酸与色氨酸的出峰顺序倒置，可能是由于不同品牌的C18色谱柱填料存在一定差异造成的。使用以上2种色谱柱时，乙酰酪氨酸峰与相邻氨基酸色谱峰均能达到分离度的要求，不影响测定结果。

[1] 李妮.小儿复方氨基酸的临床饮用与护理[J].现代医药卫生，2012，28(6)：919-920.

[2] 黎文宏.叶酸片与复方氨基酸注射液辅助治疗小儿秋季腹泻50例疗效观察[J].中国伤残医学，2014，22(1)：149-150.

[3] 王义江，吕文丽，吕银.小儿复方氨基酸联合葡萄糖酸锌治疗轮状病毒性肠炎30例疗效观察[J].中国煤炭工业医学杂志，2013，16(6)：903-904.

[4] 顾燕，钟晓萍，王承芳.小儿复方氨基酸注射液与小剂量654-2联合应用治疗小儿轮状病毒感染性腹泻的临床疗效观察[J].中国医药指南，2014，12(17)：270-271.

[5] 旷剑星，邹美容.葡萄糖酸锌口服液和小儿复方氨基酸治疗婴幼儿迁延性腹泻的疗效[J].实用临床医学，2013，14(12)：54-56.

[6] 国家药典委员会.国家药品标准新药转正标准第48册[M].北京：国家药典委员会，2004：85-87.

[7] 朱复华，陈炳新.复方氨基酸注射液制备工艺的研究[J].中国医药工业杂志，2000，31(4)：154-156.

[8] 陈宇堃，邓锋，薛巧如.利用酸水解氨基酸法测定脑蛋白水解物片中肽的含量[J].中国医药导报，2011，8(14)：66-68.

[9] 陆明，孙黛妮，汪杨，等.OPA-FMOC联用柱前衍生化法测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量[J].药物分析杂志，2010，30(12)：2323-2327.

[10] 邢健，李巧玲，耿涛华，等.氨基酸分析方法的研究进展[J].中国食品添加剂，2012，1(5)：187-191.

(编校：王冬梅)

Determination of content of acetyl tyrosine in pediatric compound amino acid injection (19AA-Ⅰ) by HPLC

CHEN Yu-kun, LIANG Wei-yangΔ

(Guangdong Institute for Food and Drug Control, Guangzhou 510180, China)

ObjectiveTo establish a method for HPLC to determine content of acetyl tyrosine in pediatric compound amino acid injection (19AA-Ⅰ).MethodsThe chromatographic separation was achieved on a Agilent Hypersil ODS column (250 mm×4.0 mm,5 μm) with Agilent 1200 liquid chromatography system.The mobile phases consisted of 20 mmol/L sodium dihydrogen phosphate solution (adjusting pH to 2.5 with phosphoric acid)-acetonitrile (90:10) at a flow rate of 1.0 mL/min, the detection wavelength was 210 nm, the column temperature was 25 ℃.ResultsAcetyl tyrosine was completely separated from other amino acids.The calibration curves for acetyl tyrosine revealed good linearity in the range of 12.062-120.62 μg/mL(r=0.9999).The average recoveries (n=9) of acetyl tyrosine was 100.0%, RSD% (n=9) was 0.9.The limits of quantification (S/N=10) was 0.15 μg/mL.ConclusionThe methodological validation results indicate that the established method can be applied to quality control of acetyl tyrosine in pediatric compound amino acid injection (19AA-Ⅰ).

acetyl tyrosine;pediatric compound amino acid injection (19AA-Ⅰ);HPLC

陈宇堃，女，本科，主管药师，研究方向：生化药品检验，E-mail:bettycyk@163.com；梁蔚阳,通讯作者,女，硕士，主任药师，研究方向：生化药品及生物制品质量控制工作；E-mail: wl-1023@163.com。

R927.2

A

1005-1678(2015)05-0166-03