巨球百合无菌播种影响因素的研究

马怡迪，李岳，李丹青，任梓铭，夏宜平

(浙江大学农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058)

巨球百合(Lilium brownii F. E. Brown ex Miellez var.giganteum) 是野百合(L. brownii)的变种。野百合鳞茎直径2 ～4.5 cm，而巨球百合在野生状态下鳞茎直径可达10 ～12 cm，鳞片100 余枚，花冠淡黄色，通常有5 ～8 朵花，因其鳞茎特大，富含矿质元素硒，花多而美丽，可供药用、食用及观赏，是百合育种的优良基因材料，具有较高的开发利用价值[1–2]。

无菌播种获得组培苗是一种有效的保存珍稀植物的方法，成功的离体组织培养能够在短时间内获得大批量的植物材料[3]。有关光照、温度等因子对百合属种子萌发的影响已有较多报道[4–11]，而有关种子无菌播种的研究主要集中在兰科植物[12–18]，百合属植物此方面的研究报道较少。吴昀等[19]、崔祺等[20]和向地英等[21]经研究得出了药百合(L. speciosum Thunb. var.gloriosoides Baker)、淡黄花百合(L. sulphureum Baker)和百合杂交种子无菌播种的最适培养基配方。杜方等[22]认为巨球百合与野百合的聚类很近。百合属植物种子无菌播种已有报道，说明其种子无菌播种可行性强。巨球百合鳞茎资源珍稀，不易获得种球，属需保护的稀有野生种质资源，因此，其种子无菌播种的研究具有理论和实践意义。

本试验以巨球百合种子为材料，比较不同激素配比的培养基对种子萌发的影响，旨在找出巨球百合种子萌发的最适激素配比，为保护巨球百合野生种质资源，加快无性繁殖提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为2014年8月下旬于浙江省温州市海岛采集的已成熟野生巨球百合蒴果。选择饱满、胚清晰(胚长≥1/2 种长)的种子为试验材料(图1)。种子千粒重为4.689g。

图1 巨球百合种子 Fig. 1 Seeds of L. brownie F. E. Brown ex Miellez var.giganteum

试验所用基本培养基均为MS 培养基，并添加9 种不同配比的6–BA 及NAA，以不添加任何激素的MS 培养基(空白培养基)为对照，培养基的pH 值为5.9。培养基在121℃灭菌20min。具体配方见表1。

表1 培养基配方 Table 1 The formula of different culture mediums

1.2 方法

试验于2014年9月至2015年2月在浙江大学观赏植物生长发育与分子生物学实验室进行。无菌培养室光照度约2 000 lx，每天光照14 h，温度(25±2 )℃。试验参考吴昀等[19]的药百合种子无菌播种的方法进行。将种子置于添加吐温–20 及洗洁精各1 ～2 滴的水溶液中浸泡 30min，去除浮起的干瘪种子，流水下冲洗 2 h，75%乙醇消毒30 s，2% NaClO 振荡处理6min，无菌重蒸水冲洗5 ～6次，放滤纸上吸干水分。将经过处理的种子平均分成2份：1 份作剥皮处理；另一份种子不剥皮。之后，分别接种于10个培养基(表1)上，每个处理接种10粒种子，重复4次。

1.3 观察与统计方法

种子接种试验开始后每天观察1次，记录种子开始萌发时间，之后每隔3 d 观察和统计1次。接种至第45天时统计萌发率、诱导率及诱导芽数等，并于第45天时将萌发种子转入含空白培养基的柱形瓶中，每瓶转接5 粒，在柱形瓶中生长45 d 后统计小鳞茎数，测量小鳞茎宽度及小鳞茎高度等指标，其中，种子萌发以胚根和幼芽突破种皮为准[23]。

萌发率=(发芽种子数/总接种种子数)×100%；

诱导率=(诱导出芽的种子数/总接种种子数)× 100%；

诱导芽数=诱导芽总数/分化芽的种子数。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2007和IBM SPSS 20对数据进行方差分析和因素内多重比较。

2 结果与分析

2.1 剥皮处理对巨球百合种子萌发的影响

无菌播种45 d 时统计的萌发率(表2)表明，10个不同培养基处理中有8个剥皮处理种子的开始萌发时间早于不剥皮处理；8个剥皮处理种子高峰期延续时间均短于不剥皮处理种子；9个不剥皮处理种子的萌发率在70.0%以上，不同编号培养基之间差异不显著，而10个剥皮处理种子的萌发率均在77%以上，且大部分剥皮处理种子的萌发率略高于不剥皮处理。综合来看，剥皮处理较不剥皮处理更有利于巨球百合种子的萌发。

表2 不同培养基与种子剥皮与否对种子萌发的影响 Table 2 Effects of different culture mediums and peeling treatments onseedgermination

2.2 不同激素配比对剥皮种子萌发的影响

剥皮处理种子生长45 d 时，1 号和6 号培养基上的种子的萌发率均达到100%(表3)，显著高于3、5、9、10 号培养基处理；1 号培养基上的种子诱导率达90.0%，显著高于2、3、5、6、7、8、9 号培养基处理，且其茎和根也较长，生长势良好(图2)；对诱导芽数而言，不同编号培养基之间并无显著差异。综合分析，1 号培养基激素配比更有利于巨球百合种子的萌发。

表3 不同培养基对剥皮种子萌发的影响 Table 3 Effects of different culture mediumson thegermination of seeds with peeling treatment

图2 不同培养基上生长45 d 的巨球百合种子(剥皮处理) Fig.2 Seeds(with peeling treatment)after 45 days'growthon different culture mediums

2.3 萌发种子转入MS 培养基后生长45 d 的情况

从表4 和图3 可知，不同编号培养基上的萌发种子转入MS 培养基生长45 d 后，在小鳞茎数、小鳞茎高度、小鳞茎宽度、叶片数以及生根数等指标上表现出了差异，其中3 号培养基上的小鳞茎个数较多(图4)，平均达3.57个，显著高于其他处理，2、6 和8 号培养基上的小鳞茎个数亦较多，显著高于对照。

表4 萌发种子转接后生长45 d 的各项生长指标 Table 4 Thegrowth ofgermination seeds after transferred to MS basal medium for 45 days

图3 萌发种子转接后生长45 d 的观察结果 Fig. 3 Thegrowth ofgermination seeds after transferred to MS basal medium for 45 days

图4 3 号培养基上的种子转入MS 培养基45 d 后获得的丛生小鳞茎 Fig.4 Clumping bulblets from seeds in No.3 Medium after transferred to MS basal medium for 45 days

3 结论与讨论

百合属种子具有坚厚的种皮，会对种子萌发形成较大的机械阻碍，使其不能吸收足够水分，导致生长停滞、萎缩甚至死亡[19,24]。有研究[19–20,24–25]表明，通过预冷、预热处理擦破种皮，或直接剥除种皮，可以显著提高种子的萌发速度和萌发率，本试验结果与其结论接近。孙叶等[18]发现，利用NaClO 溶液预处理兰花杂交种子，能明显提高其萌发率。在本试验中，采用NaClO 溶液振荡处理巨球百合种子，既能对种子进行消毒，又能腐蚀种皮，同时溶解一些种皮内含有的酸性抑制物，且在实际操作中，延长无菌水冲洗时间，可一定程度软化种皮，去除种皮表层的蜡质和油脂，增强皮透性，减轻剥皮处理难度，提高萌发率[18–19]。

吴昀等[19]得出药百合种子无菌播种最适培养基为MS+1.0mg/L 6–BA + 0.1mg/L NAA；向地英等[21]和周晓杰等[25]均认为MS+1.0mg/L 6–BA +0.01mg/L NAA 为百合杂交种子无菌播种的最适培养基。综合考虑各因素，巨球百合种子萌发的最适培养基为MS+1.0mg/L 6–BA+ 1.0mg/L NAA。此培养基培养巨球百合种子，种子萌发率为100.0%，诱导率为65.0%，平均诱导不定芽1.28个，转入MS 培养基生长45 d 后，平均形成小鳞茎2.35个，平均生成3.6片叶，生根6.7 条，萌发种子转接后的各项生长指标均优于1 号培养基，且植株生长比1 号培养基的植株健壮，说明1.0mg/L 6–BA 的培养基较适合百合属种子萌发，这与前人的研究结果相符。当细胞分裂素与生长素的比值高时，6–BA 和NAA 的不同配比可诱导芽的分化；比值低时，则促进根的生成[26]。从吴昀等[19]、向地英等[21]、周晓杰等[25]和本试验结果来看，最适培养基中的细胞分裂素与生长素的比值均较高，所对应的诱导芽数也较多，充分印证了这一观点。

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