东北三省不同产地龙胆HPLC指纹图谱的研究

范卓文，姚 莉，谢 明，李 龙，陈忠新，孙建华

(1.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨150040;2.哈药集团中药二厂，哈尔滨150078;3.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010)

中药龙胆为龙胆科植物龙胆、三花龙胆或坚龙胆等的干燥根及根茎，主要分布在黑龙江、辽宁、吉林、贵州、云南等地[1－2].龙胆性味苦、大寒、无毒，具有泻下焦郁火、清肝胆湿热之功效，常用于湿疹瘙痒、带下、阴肿阴痒、耳鸣、胁痛等症状[3].现代研究表明龙胆中含有黄酮类、多糖环烯醚萜类、生物碱类、有机酸、挥发油等多种化学成分，其中多糖环烯醚萜类、生物碱类、黄酮类为其主要活性成分[4].对龙胆的指纹图谱研究的报道已有很多，但是对龙胆的不同产地指纹图谱的研究甚少[5－6].本实验建立了龙胆高效液相指纹图谱的色谱条件，并对东北三省不同产地的龙胆进行研究.

1 仪器与试药

1.1 仪 器

岛津LC－2010AHT高效液相色谱仪(日本岛津公司)，FA2004型电子天平(上海良平仪器代表有限公司)，KQ－500型超声波清洗器(山市超声仪器有限公司).

1.2 试 药

龙胆苦苷(批号:MUST－12090406)，其购自中国成都曼思特生物科技有限公司;甲醇:色谱纯(DikmaPure);甲醇:分析纯(天津市天力化学试剂有限公司);水:娃哈哈纯净水;东北三省龙胆分别采自黑龙江、辽宁、吉林，由黑龙江中医药大学实验中心高级实验师郭淑艳鉴定为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana)北龙胆(Gentianachinensis)，见表1;东北三省龙胆根茎经清洗、阴干、粉碎、烘干、过四号筛备用.

表1 东北三省不同产地的龙胆样品来源

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

按照中国药典2010版一部，精密称取龙胆苦苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含有0.2 mg的溶液，溶解、摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，备用.

2.2 供试品溶液的制备

称取各产地干燥的龙胆根茎粉末(过四号筛)0.5 g，精密称定，精密加入甲醇20 mL，称定质量，加热回流15 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液备用，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得.

2.3 色谱条件

色谱柱 Spherisorb－C18(4.6×250 mm，5 μm)，水(A)－甲醇(B)进行梯度洗脱:0～5 min，0～40%B;5～15 min，40% ～60%B;15～25 min，60% ～80%B;25～30 min，80% ～100%B;30～40 min，100% ～ 100%B;流速:1.0 mL/min;检测波长:270 nm;柱温:30℃;进样量:10 μL;检测时间:40 min.

2.4 测定方法

分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪中，进行检测.色谱图见图1、2.

图1 龙胆苦苷色谱图

图2 供试品HPLC指纹图谱

2.5 方法学考察

2.5.1 稳定性实验

精密称取S3号样品适量，按照供试品溶液制备方法处理并按照梯度洗脱条件进样测定，在0、1、2、4、8、12 h 进行测定分析，结果发现其主要共有峰相对峰面积的RSD值均小于2.98%及相对保留时间的RSD均小于2.79%，表明样品溶液在12 h内稳定.

2.5.2 精密度实验

精密称取S9号样品适量，按照供试品溶液制备方法处理并按照梯度洗脱条件进样测定，重复进样测定6次，结果发现其主要共有峰相对峰面积的RSD均小于2.97%及相对保留时间的RSD值均小于2.69%，表明仪器和方法的精密度良好.

2.5.3 重复性实验

精密称取S12号样品适量，6份，按照供试品溶液制备方法处理并按照梯度洗脱条件进样测定.色谱图中各主要共有峰的相对峰面积的RSD值均小于2.92%，相对保留时间的 RSD值均小于 2.30%，结果表明该方法的重复性良好.

图3 12批次龙胆的色谱图叠加图

2.6 指纹图谱的建立

取东北三省不同产地的12批龙胆样品，按照前面确定的方法进行样品测定，记录指纹图谱，如图3所示.将所测数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件，以龙胆主要成分龙胆苦苷为内参比峰，比对其色谱峰对内参比峰的相对保留时间定性，得到13个共有峰，建立起共有模式，结果见表2、3及图4.

图4 共有模式图

表2 12批次龙胆共有指纹峰相对保留时间

表3 12批次龙胆共有指纹峰相对峰面积

3 结论

通过对东北三省不同产地龙胆的提取物指纹图谱的研究，对所得色谱峰进行比较，可以得出以下结论:

1)不同产地的龙胆苦苷含量基本呈现:辽宁省地区＞吉林省地区＞黑龙江省地区.分析其原因为:不同的产地、不同的气候条件、栽培管理与加工环节的差异等因素起到了一定的作用.

2)东北三省不同产地的龙胆指纹图谱显示:HPLC图谱比较接近，没有明显的差别，12批不同产地龙胆药材的特征峰的专属性和特征性较好，说明东北地区的龙胆，即北龙胆的化学成分基本相同.

[1]刘 涛，才 谦，付玉芹，等.中药龙胆的研究进展[J].辽宁中医杂志，2004，31(1):85－86.

[2]徐丽萍，刘建生，敏 德，等.金龙胆草的化学成分研究(Ⅰ)[J].中国中药杂志，1998，23(5):37－39，64.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2010.

[4]王 宁.秦岭龙胆化学成分的定性分析[J].青海大学学报:自然科学版，2004，22(6):1－2.

[5]孙国祥，侯志飞，张春玲，等.色谱指纹图谱定性相似度和定量相似度的比较研究[J].药学学报，2007，42(1):75－80.

[6]张海晶，金 兰，于金平，等.鸡冠花乙醇提取物的HPLC指纹图谱研究[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版，2014，30(1):18 －20，24.