分子检测显示6个彩色马铃薯品种为常规品种

田雨，何欢，贺蕾

（1.湖北省武昌实验中学，430060；2.华中农业大学湖北马铃薯工程技术研究中心）

分子检测显示6个彩色马铃薯品种为常规品种

田雨1，何欢2，贺蕾2

（1.湖北省武昌实验中学，430060；2.华中农业大学湖北马铃薯工程技术研究中心）

本研究收集了6个彩色马铃薯品种，根据转基因技术原理，采用聚合酶链式反应技术（PCR），用马铃薯转基因常用35S启动子和筛选标记卡那霉素基因特异引物分析了彩色马铃薯是否为转基因马铃薯品种。试验结果表明，6个彩色马铃薯品种PCR扩增结果均为阴性，表明这些彩色品种并非转基因品种，这些品种实际上是经过常规杂交选育而成。

彩色马铃薯；转基因；分子检测

马铃薯富含大量优质淀粉、纤维素、蛋白质和人体必需的8种氨基酸，富含维生素C和多种B族维生素，钙、磷、镁、钾含量也很高，还含有微量元素，是一种健康营养的蔬菜[1]。随着我国人民生活水平的提高和膳食结构的改善，马铃薯越来越受到广大消费者和市场的青睐。近年来一些彩色马铃薯在市场上流行起来，彩色马铃薯含有大量的纯天然花青素和绿原酸等多酚类抗氧化活性物质，具有抗氧化、抗衰老功能，是集营养、保健和天然色素于一体的新品种，成为很多消费者追捧的健康美食[2]。

随着转基因技术的发展，一些转基因植物被释放。目前我国共批准发放7种转基因作物安全证书，分别是抗虫棉花、改变花色矮牵牛、耐储存番茄、抗病辣椒、抗病番木瓜、转植酸酶玉米和抗虫水稻[3]。但实现大规模商业化生产的只有抗虫棉和抗病毒木瓜，抗病辣椒和耐储存番茄在生产上并未被消费者接受，故未实现商业化种植，而抗虫水稻和转植酸酶玉米未完成后续的品种审定，未进行商业化种植[3]。

转基因一般用农杆菌作表达载体，载体上有一个可转移“T-DNA”区段，该区段最后插入植物基因组中，转基因过程会在植物基因组中留下“痕迹”[4，5]。一般在“T-DNA”区段包含2个表达框架，一个是在35S启动子驱动下的目的基因表达框架，一个是选择标记基因表达框，马铃薯转基因研究一般用卡那霉素抗性基因。理论上马铃薯转基因如果用了35S启动子和卡那霉素抗性基因，转基因植株中就会含有这些区段。分子检测手段是国际上进行转基因鉴定的通行做法。

因对转基因技术不了解或存在安全顾虑，再加上一些不明真相的人有时散发一些谣言，到处传播彩色马铃薯是通过转基因得到的，广大民众为此产生困惑。尽管世界上一些科学家正在进行马铃薯转基因研究，但目前世界上还没有转基因马铃薯获得环境释放和大面积栽培。为了释疑公众对彩色马铃薯是否是转基因产品的疑惑，选了6个彩色马铃薯品种或品系，利用灵敏的分子生物学方法通过探测“痕迹”有无来确认品种是否为转基因马铃薯。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为6个马铃薯品种，分别为紫云1号（紫皮紫肉）、转心乌（紫皮紫肉）、华彩1号（红皮红肉）、黑玫瑰（紫皮紫肉）、River John Blue（紫皮紫肉）、Purple Congo（紫皮紫肉），均为华中农业大学湖北马铃薯工程技术研究中心保存，对照为早大白（白皮白肉）和夏波蒂（黄肉）。

1.2 块茎DNA抽提

从每个洗净的马铃薯薯块上用打孔器取下一个长条，切取100 mg薯肉放于2 mL离心管中，然后加入2%CTAB DNA抽提缓冲液300 μL（2%CTAB，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0），4 μLβ-巯基乙醇，放入1个小瓷珠，用磨样机进行破碎，5 m/s×5 s 3次，破碎完后在65℃水浴锅中水浴1 h，期间每隔15 min摇动1次。待冷却至室温后，12000 r/min离心10min，吸取上清液，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）轻轻摇动混匀，12 000 r/min离心15 min。吸取上清液到新的1.5 mL离心管中，加入等体积冰冷的异丙醇，摇匀，-20℃沉淀1 h。12 000 r/min 4℃离心10 min，去上清液，可见离心管底部有白色沉淀，用1 mL 75%乙醇洗涤沉淀1～2次，室温下干燥，溶于100 μL ddH2O中。最后用电泳方法检测DNA质量。

1.3 PCR扩增

引物设计：35S启动子（35S-F：5'-CAGAACTCGCCGTAAAGACT-3'，35S-R：5'-GCGTCATCCCTTACGTCAGTG-3'，产物430 bp）和卡那霉素抗性基因特异引物（NPTⅡF：5'-AGACAATCGGCTGCTCTGAT-3'，NPTⅡR：5'-TCATTTCGAACCCCAGAGTC-3'，产物676 bp）进行扩增。β-tubulin特异引物（Tub-F：5'-TGGACAGTCTGGTGCTGGGA-3'和Tub-R：5'-GCCAGGGAATCTCAAACAG-3'，产物456 bp）作为检测PCR反应的内参。

PCR扩增：在PCR管中加入各种试剂，20 μL体系：10×Buffer with MgCl22 μL，dNTPs（2 mmol/L）2 μL，左右引物（2 mmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，不足部分用ddH2O补充。最后滴1滴矿物油覆盖，放在Biometra II PCR仪上自动扩增，扩增循环：预热95℃，5 min；变性94℃，30 s；退火56℃，30 s；延伸72℃，1 min；32个循环（变性-退火-延伸）；最后一次延伸72℃，5 min；保育10℃，停止。PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。

2 结果与分析

2.1 DNA抽提与检测结果

马铃薯DNA抽提完毕溶解于ddH2O中，由于抽提薯块有色素，抽提DNA沉淀溶解后稍有一些颜色。取出8 μL电泳，在凝胶成像系统下观察，所有材料都有一个亮带（图1），确认所有马铃薯DNA都抽提成功。将DNA稀释10倍用于PCR扩增。

2.2 35S启动子和卡那霉素抗性基因特异引物扩增结果

以提取的总DNA为模板，用植物转基因表达转载体pBI121空载体（载体上含有35S启动子和卡那霉素抗性基因）为阳性对照，分别以35S启动子和卡那霉素抗性基因特异引物扩增。图2表明，8个马铃薯中都可以扩增出β-tubulin特异条带，表明PCR扩增反应正常。阳性对照可以扩增出35S启动子和NPTⅡ基因特异条带。但是8个马铃薯包括彩色马铃薯中并未扩增出产物，说明6个彩色马铃薯和另外2个常见栽培品种都不含35S启动子和NPTⅡ基因。

3 讨论与结论

本研究利用灵敏的分子生物学方法通过探测“痕迹”35S启动子和卡那霉素抗性基因的有无来确认品种是否为转基因马铃薯。研究结果显示，收集的6个彩色马铃薯和2个常规品种一样，35S启动子和卡那霉素抗性基因特异引物扩增都为阴性，表明它们都不是转基因马铃薯。

马铃薯起源于南美安第斯山脉，具有丰富的遗传多样性[6]。在马铃薯的故乡秘鲁，马铃薯块茎皮色和肉色多样，有黄色、红色、蓝紫色、紫罗兰色以及粉色等。多种颜色的马铃薯堆在一起，看上去五彩缤纷，像是五颜六色的海洋。马铃薯不仅颜色多样，而且薯形也是千奇百怪，有圆形、长形，也有的像手掌、有的弯钩状、有的螺旋形，表现出极大的多样性

图1 8个马铃薯品种抽提DNA电泳检测

图2 35S启动子和卡那霉素抗性基因特异引物扩增

图3五彩缤纷的马铃薯（图3）。在安第斯山脉，有许多原始栽培品种本来就是色彩斑斓[7]。只是马铃薯从安第斯山脉向外传播时，只有极少数品种被引种到欧洲和世界各地。在传播过程中只有极少数彩色品种传入我国，因此缺乏多样性。国内人们习惯了马铃薯比较单一的性状，对五彩缤纷的马铃薯世界并不了解，因此，一见到薯肉为彩色的马铃薯就误以为是转基因马铃薯。近年来我国一些育种单位开始重视彩色马铃薯的选育，通过引种和杂交育种也培育出了一些品种，例如云南省农业科学院育成紫云1号，西北农林科技大学育成玫瑰系列彩色马铃薯新品种等，这些彩色马铃薯都是用常规育种技术育成。因此消费者没有必要担心彩色马铃薯品种为转基因马铃薯。利用转基因技术培育新品种是未来科技发展趋势，当然也应关注转基因技术的安全问题，但是人们应该用科学的眼光公正看待转基因植物，全盘否定、谈转基因植物就“色变”的做法是不科学的。科学家有义务向公众科普转基因技术，而公众有知情权和选择是否消费转基因食品的自由与权利。参考文献

[1]吕巨智，染和，姜建初.马铃薯的营养成分及保健价值[J].中国食物与营养，2009（3）：51-52.

[2]李倩，柳俊，谢从华，等.彩色马铃薯块茎形成和贮藏过程中花色苷变化及抗氧化活性分析[J].园艺学报，2013，40（7）：1 309-1 317.

[3]国家农业生命科学技术科普基地.转基因作物与我们的生活[M].北京：科学出版社，2011.

[4]何光源.植物基因工程[M].北京：清华大学出版社，2007.

[5]颜启传，曹立勇，魏兴华.植物转基因品种鉴定的原理与技术[M].北京：中国农业科技出版社，2007.

[6]CIP.Cross-Cutting Efforts Optimize Food Security,Nutrition and Livelihood[M].Lima:International Potato Center, 2015.

[7]国际马铃薯中心.秘鲁万卡约本地马铃薯品种目录[M].刘作易，雷尊国，范士杰，译.贵阳：贵州科技出版社，2010.

Six Colored Potatoes Identified as Conventional Varieties through Molecular Detection

TIAN Yu1,HE Huan2,HE Lei2

(1.Wuchang Experimental High School in Hubei,Wuhan 430061; 2.Potato Engineering and Technology Research Center of Hubei Province,Huazhong Agricultural University)

In recent years,colored potatoes became popular among the market.The tuber flesh color of colored potatoes changed from red to purple,colored potatoes contained plenty of anthocyanin with the functions of antioxidant and antiaging which became healthy food loved by consumers.But some consumers‘worries are these colored potatoes are transgenosis potatoes.In this paper,we collected six colored potato varieties,took the polymerase chain reaction technique based on GM technology.We analyzed whether colored potatoes were transgenic potatoes due to the primers of common 35S promoter and selection marker kanamycin gene.The results showed that PCR amplifications of six colored potato varieties were negative,it conducted that these colored varieties were not transgenic varieties,they were bred by conven tional hybridization mode.

Colored potato;Transgenic;Molecular identification

S532

A

1001-3547（2015）20-0043-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.20.017

田雨（1998-），女，湖北省武昌实验中学高二（理科4班），

E-mail：1832480116@qq.com

何欢（1993-），女，通信作者，硕士研究生，主要从事马铃薯资源研究，E-mail：284624399@qq.com

2015-07-16