血必净注射液中洋川芎内酯I的降解动力学研究*

高　杰，蒲位凌，任晓亮，任德飞，孙立丽，戚爱棣（天津中医药大学中药学院，天津300193）

·中药研究·

血必净注射液中洋川芎内酯I的降解动力学研究*

高杰，蒲位凌，任晓亮，任德飞，孙立丽，戚爱棣
（天津中医药大学中药学院，天津300193）

［目的］研究洋川芎内酯I（Sen I）在血必净注射液及水溶液中，不同pH缓冲液、不同温度下降解的动力学规律，为血必净注射液及洋川芎内酯I的提取、贮藏及使用条件提供依据。［方法］建立高效液相色谱分析方法，考察不同pH（1～13）和温度（65、75、85、95℃）对Sen I稳定性的影响，利用速率方程、化学反应动力学模型及Arrhenius公式分析Sen I在不同条件下的降解规律并计算相关降解反应动力学参数。［结果］Sen I在碱性条件下降解较快，符合一级动力学规律，并随碱性增强，降解速度明显加快。温度对降解速度影响较大，温度升高，降解明显加快。经计算得，Sen I在水溶液和血必净注射液中降解活化能分别为177.94 kJ/mol和194.86 kJ/mol。［结论］在碱性和高温条件下，洋川芎内酯I更易降解。同样条件下，Sen I在血必净注射液中的稳定性都要高于其水溶液。

洋川芎内酯I；血必净注射液；pH；温度；降解动力学

血必净注射液是由红花、赤芍、川芎、丹参、当归等五味中药的提取物组成的现代中药制剂，具有活血化瘀，疏通脉络，溃散毒邪，消除内毒素的功效，临床主要与抗生素并用治疗脓毒症［1-5］。近年来有关血必净的不良反应也时有报道，主要为过敏和休克反应［6-9］。造成其过敏反应的可能原因之一是在高温灭菌或贮藏过程中由于有效成分降解，降解物作为半抗原，与血浆蛋白结合成为高致敏原而诱发过敏［9］。

洋川芎内酯I（Sen I）为川芎中发挥药效作用的主要成分之一。其结构如图1所示，其中含有内酯、不饱和双键等结构，容易通过氧化、水解、光解和异构化等反应发生结构改变［10-13］。左爱华等［14］研究发现，在自然光照下，Sen I通过异构化反应部分转化为其同分异构体（E）-6，7-反式-双羟基藁本内酯。Sen I的降解和新的降解产物生成都可能造成注射液质量的降低甚至过敏反应的发生。关于Sen I系统稳定性研究鲜见报道，为了更好地储存并控制其质量，有必要对其在不同条件下的稳定性进行系统分析。

图1　Sem I结构

本研究利用恒温加速法，以化学动力学为理论基础［15］，通过测定血必净注射液中的主要活性成分Sen I在不同pH及温度下含量随时间的变化，考察pH和温度对Sen I稳定性的影响，以期从血必净注射液主要活性成分在不同条件下的稳定性为切入点，对SenI和相关制剂的贮藏及使用条件提供依据。

1　仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2998 PDA检测器（美国Waters公司）；BT1250D分析天平（Sartorius公司）；HH-8S数显恒温水浴锅（金坛市盛蓝仪器制造有限公司）；DELTA 320 pH计（瑞士METTLER TOLEDO公司）；XW-80A旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）。

血必净注射液（天津红日药业股份有效公司，规格：每支10 mL，批号1205301）；Sen I对照品（南京拓海生物科技有限公司，纯度≥98%）；高效液相色谱法（HPLC）分析用甲醇为色谱纯（Sigma公司），娃哈哈纯净水，氢氧化钠、磷酸、甲酸均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×150 mm，5 mm）；流动相：甲醇（A）-0.3%甲酸水（B），梯度洗脱，见表1；流速：1 mL/min；柱温：35℃；检测波长：λ=280 nm；进样量：10 μL。其色谱图见图2。

表1　梯度洗脱条件

图2　Sen I对照品（a）和血必净注射液（b）的HPLC色谱图

2.2方法学验证

2.2.1线性关系考察精确称取10.82 mg Sen I于10 mL棕色量瓶中，以纯水定容，配制成浓度为1.082 g/L的Sen I储备液。精密量取对照品储备液适量，制得浓度分别为0.36、1.8、3.6、7.2、9.1、14.5、18.1 mg/L的系列标准溶液，按“2.1”项下的色谱条件，将上述7份对照品溶液分别进样10 μL，以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X，mg/L）为横坐标进行线性回归，得回归方程：Yˆ=4.246×104X-1 532，r=0.999 9。结果表明，Sen I在质量浓度为0.36～18.1 mg/L范围内线性关系良好。

2.2.2精密度取“2.2.1”项下浓度为7.2 mg/L的对照品溶液，重复进样6次，记录峰面积，计算得RSD值为1.2%。表明仪器及进样精密度良好。

2.2.3重复性取Sen I对照品储备液6份，分别用去离子水稀释至7.2 mg/L，进样测定。结果Sen I含量RSD为1.6%，表明方法重复性良好。

2.2.4加样回收率实验精密量取SenI储备液30μL 和500 μL血必净注射液（已知其中Sen I含量为60.7 mg/L）于5 mL棕色容量瓶中，涡旋混匀，以纯水定容至刻度。平行配制6份，分别取上述溶液10 μL进行HPLC测定，记录峰面积，通过外标法计算含量，得平均加样回收率为99.22%，RSD为1.7%，见表2。

表2　加样回收率实验（n=6）

2.3Sen I水溶液在不同环境下的稳定性研究

2.3.1不同pH的缓冲液及Sen I储备液的配制用适量浓盐酸、磷酸钠、氢氧化钠溶液配制pH 1～13的一系列缓冲液。另外，将10 mL棕色容量瓶高温高压灭菌后，精确称取10.82 mg Sen I于容量瓶中，以甲醇定容，配制成浓度为1.082g/L的SenI储备液。

2.3.2Sen I在不同pH下的稳定性研究取Sen I储备液50 μL，置于经高温高压灭菌5 mL的棕色容量瓶中，用一系列缓冲溶液分别定容至刻度，涡旋混匀，得到Sen I在不同pH条件下的样品溶液，分别用HPLC测定溶液中Sen I的初始浓度（C0）。将样品溶液密封并于室温条件下放置，间隔一定的时间对样品取样，测定溶液中Sen I的剩余浓度（Ct）。按照上述方法重复实验1次。以Sen I相对剩余浓度的对数［ln（Ct/C0）］与时间（t）作图，见图3。Sen I在中性和酸性条件下稳定，在碱性条件下不稳定，且随碱性增强，降解明显加快。

2.3.3SenI在不同温度下的稳定性研究移取50μL Sen I储备液置于5 mL灭菌容量瓶中，以超纯水定容，混匀，制得样品溶液，并分别用HPLC测定溶液中Sen I的C0。将样品溶液密封，分别置于温度为65、75、85、95℃的恒温水浴锅中，间隔一定的时间对样品取样，测定溶液中Sen I的Ct。按照上述方法重复实验1次。以Sen I ln（Ct/C0）与t作图，见图4。通过对Sen I在水溶液中在不同温度下降解得到的拟合曲线方程可知其表观速率常数k，并根据Arrhenius方程lnk=lnA-Ea/RT，可计算其降解反应活化能，结果见表3。结果表明，Sen I在水溶液中的降解反应速率随温度的升高而加快，该反应呈现一级动力学规律，反应的活化能较高，表明Sen I常温下在中性水溶液中较为稳定性。

图3　不同pH缓冲液中Sen I lnCt/C0与t的关系图

图4　Sen I在不同温度下lnCt/C0与t的关系图

表3　在不同温度下Sen I降解动力学曲线拟合结果

2.4Sen I在血必净注射液中的稳定性研究

2.4.1血必净注射液中的Sen I在不同pH下的稳定性研究用适量浓盐酸、磷酸钠、氢氧化钠溶液配制pH1～13的一系列缓冲液。取血必净注射液1 mL，置于经高温高压灭菌的5 mL棕色容量瓶中，用一系列缓冲溶液分别定容至刻度，涡旋，得注射液在不同pH条件下的样品溶液，分别用HPLC测定溶液中Sen I的C0。将样品溶液密封并于室温条件下放置，间隔一定的时间对样品取样，测定溶液中Sen I 的Ct。按照上述方法重复实验1次。以Sen I ln（Ct/ C0）与t作图，见图5，可知注射液中Sen I的降解模型符合一级动力学。根据数据可知注射液中Sen I在碱性环境中不稳定，在酸性和中性条件下稳定。

图5　不同pH下Sen I在血必净注射液中lnCt/C0与t的关系图

2.4.2血必净注射液中的Sen I在不同温度下的稳定性研究移取1 mL血必净注射液于5 mL灭菌容量瓶中，以超纯水定容，混匀，制得样品溶液，并分别用HPLC测定注射液中Sen I的C0。将样品溶液密封，分别置于温度为65、75、85、95℃的恒温水浴锅中，间隔一定的时间对样品取样，测定溶液中Sen I的Ct。按照上述方法重复实验1次。由不同时间对Sen I ln（Ct/C0）与t作图，见图6。通过对Sen I在注射液中不同温度下降解得到的拟合曲线方程可知其表观速率常数k，并根据Arrhenius方程lnk= lnA-Ea/RT，可计算其反应活化能，结果见表4。结果表明，Sen I在血必净注射液中的降解反应速率随温度的升高而加快，该反应呈现一级动力学规律，反应的活化能较高，表明Sen I在血必净注射液中较为稳定性。

2.5各pH条件下的半衰期和有效期预测Sen I分别在水溶液和血必净注射液中不同pH下降解，测得两种介质中Sen I的相对剩余含量，根据一级反应速率方程ln（C0/Ct）=kt，计算降解速率常数k、有效期t0.9和半衰期t0.5，见表5。Sen I在不同溶液中降解速率常数（lnk）对pH作图，见图7。结果表明，Sen I在水溶液和血必净注射液中的降解趋势一致，在注射液中的稳定性稍高于水溶液中。

图6　在不同温度下Sen I在血必净注射液中ln（Ct/C0）与t关系图

表4　在不同温度下注射液中Sen I降解动力学曲线拟合结果

表5　在不同pH溶液中Sen I实验结果的比较

图7　在不同溶液中Sen I的lnk比较

2.6各温度下半衰期及有效期预测Sen I分别在水溶液和血必净注射液中不同温度（65、75、85、95℃）下降解，测得两种介质中Sen I的相对剩余含量相比较，根据公式t0.5=ln2/k和t0.9=0.105 4/k预测有效期t0.9和半衰期t0.5，见表6。结果表明，Sen I在水溶液和血必净注射液中的降解趋势一致，在注射液中的稳定性高于水溶液中。

表6　在不同温度下Sen I实验结果的比较

3　结论与讨论

实验结果表明，在碱性和高温条件下，Sen I的降解属于一级动力学反应。通过对比Sen I在水溶液和血必净注射液中的降解速度可知，两者降解趋势大体一致，但Sen I在血必净注射液中比在水溶液中稳定性大大提高，即制剂水平下Sen I较稳定。本实验结果提示Sen I的提取、使用、贮存应避免碱性环境，为相关制剂研究和质量控制提供了依据。

在pH1～13一系列的缓冲溶液体系下，Sen I在酸性环境中比较稳定，几乎未发生降解。另外，为准确表征其降解速率变化较快的区间，水溶液实验中在降解速度变化较大的pH区间（pH 9～11）进一步缩小pH间隔以更精确的描绘降解速率随pH变化的趋势。实验结果显示，在注射液和水溶液中，lnk 对pH进行回归分析（图7），基本呈线性。该实验结果可以用来粗略计算在不同pH条件下Sen I的降解速率常数，预测剩余含量。

Sen I为内酯型结构，其中含有不饱和共轭双键。内酯在碱催化下较易发生水解开环反应；双键易发生氧化、异构化等反应。在对其降解的样品进行梯度洗脱，发现其中有几种新物质出现，初步判定其为Sen I的降解产物。其降解产物及降解机制需进一步实验确定。

波长及流动相选择：考虑分析时间及分离效果等因素，采用甲醇-甲酸水为流动相，由于注射剂成分较复杂，采用梯度洗脱，排除其他成分干扰。Sen I的最大吸收波长为280 nm，在此波长下，Sen I响应值较高，而且在该色谱条件下，其他成分不干扰Sen I测定，故选择280 nm为测定波长。

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Degradation kinetics of Senkyunolide I in Xuebijing injection

GAO Jie，PU Wei-ling，REN Xiao-liang，REN De-fei，SUN Li-li，QI Ai-di
（College of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study the degradation kinetic characteristics of Senkyunolide I（Sen I）in Xuebijing injection and aqueous solution under different pH buffer and temperatures.［Methods］HPLC method was established to study the effect on the Senkyunolide I under different pHs and temperatures（65，75，85，95℃）.Based on the chemical reaction kinetics and Arrhenius equation，the model of degradation of Sen I and the parameters of degradation kinetics were confirmed.［Results］The results indicated that the degradation of Sen I in aqueous solution and Xuebijing injection conforms to the first-order degradation kinetic.In the injection and aqueous solution，respectively，the energy of activation（Ea）was 177.94 kJ/mol and 194.86 kJ/mol.［Conclusion］Sen I is unstable in alkaline solution and high temperature in both aqueous and Xuebijing injection.Under the same condition，Sen I in Xuebijing injection was more stable than that in aqueous solution.

Senkyunolide I；Xuebijing injection；pH；temperature；degradation kinetics

R285.5

A

1673-9043（2015）03-0160-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.03.09

教育部高等学校博士学科点专项科研基金（2011 1210110010）。

高杰（1986-），男，硕士研究生，主要从事中药注射液成分分析及安全性方面的研究。

任晓亮，E-mail:xiaoliang_ren@sina.com。

（2015-01-15）