ICAM-1 469K/E基因多态性与突发性聋的相关性研究

张芳　田广永　黄仲曦　段永畅　杨静雅　唐玲南方医科大学第三附属医院耳鼻咽喉头颈外科南方医科大学基础医学院肿瘤研究所南方医科大学第三附属医院图书馆

ICAM-1 469K/E基因多态性与突发性聋的相关性研究

张芳田广永黄仲曦段永畅杨静雅唐玲
南方医科大学第三附属医院耳鼻咽喉头颈外科南方医科大学基础医学院肿瘤研究所南方医科大学第三附属医院图书馆

目的探讨细胞粘附分子-1（ICAM-1）469K/E基因多态性是否与突发性聋存在相关性。方法 按照入选标准共选取了240例研究对象，包括突发性聋患者75例（男39例，女36例），对照者165例（男86，女79例），分别抽取2ml外周静脉血，提取DNA，PCR扩增目的片段，扩增产物经限制性酶切后行琼脂凝胶电泳，以此确定所有研究对象ICAM-1 469K/E的基因分型。通过统计分析明确ICAM-1 469K/E与突发性聋是否相关。 结果 两组之间ICAM-1 469K/E基因分型及等位基因分布频率差异无统计学意义，但在不同听力下降类型中ICAM-1 469K/E基因多态性分布频率存在差异，听力平坦下降型携带E等位基因的基因型及E等位基因分布频率高于其他听力下降类型，且差异有统计学意义。结论 ICAM-1 469K/E基因多态性与突发性聋不存在明显的相关性，携带E等位基因可能是引起听力平坦下降的危险因素。

突发性聋；ICAM-1；基因多态性

突发性聋（以下简称突聋）是指72h内突然发生的、至少在相邻的两个频率听力下降≥20dBHL的感音神经性听力损失，其病因尚未明确［1］。主要的病因假说包括病毒感染、内耳微循环障碍、自身免疫疾病、脂质代谢紊乱、中枢神经系统异常等，其中内耳微循环障碍被认为是不同病因最后致病过程中的共同途径［2］。目前认为突发性聋是一种多因素疾病，可能由遗传因素及环境因素相互作用引起。遗传因素在突聋发病中的作用，以及对疾病进展、预后的影响是新的研究热点。

内听动脉亦称为迷路动脉，与颈内、颈外动脉吻合支纤细，因缺少有效的侧支循环，易引起内耳缺血。位于耳蜗的毛细胞对于缺血极其敏感，缺血1小时后即可导致毛细胞形态学上不可逆的改变［3］。结合内耳血供、毛细胞的生理特点，以发病急、病程进展快为主要临床特征的突发性聋类似于心血管事件。而动脉粥样硬化在心血管事件中发挥着重要的作用，越来越多研究表明动脉粥样硬化是慢性血管炎症性疾病。在冠心病和突聋患者血浆中均发现炎性标记物表达升高［4，5］。突聋的影像学研究亦提示炎症可能参与疾病的发生发展。Berretini等［6］通过的3D-FLAIR MRI成像发现突聋患者内耳信号强度增高，提示内耳有轻度出血、急性炎症反应以及血迷路屏障障碍的现象。同样在Yoshida等［7］对突聋患者3D-FLAIR MRI成像中，内耳高信号提示炎症可能参与突聋的发病过程，并影响疾病预后。基因的改变可影响转录及翻译，从而使相应的产物含量、生物活性发生改变。研究发现炎症相关基因的多态性与突发性聋的发病及预后存在相关性。迄今为止，提出的存在这种相关性的基因有IL-1β（-511C/T、+3953C/T）、IL-1 889C/T、IL-6 174G/G、IL-6 C-572G、IL-4R Q576R等等［8-12］。尽管已发现这些炎症因子多态性与突聋存在相关性，但突聋的遗传易感基因仍未完全明确。为了能够找到突聋的易感基因，有必要对其他炎症相关的候选基因进行研究。Quaranta等［13］通过病例对照研究发现，突发性聋患者血浆中ICAM-1含量显著升高（p＜0.001），提示ICAM-1含量变化与突聋的发病存在相关性。研究表明ICAM-1基因多态性与动脉粥样硬化存在明显的相关性［14，15］。但目前关于ICAM-1基因多态性与突发性聋的相关性研究，国内外尚无相关报道。我们利用限制性内切酶片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR-RFLP）技术检测ICAM-1 469K/E多态性，探讨ICAM-1 469K/E多态性与突发性聋发病及预后的关系。

1　资料与方法

1.1研究对象

选取从2014年6月至2015年7月在耳鼻咽喉头颈外科门诊就诊的75例突聋患者为病例组，从健康体检中心选取165对照者。病例组入选的标准为：突发性听力下降，纯音听阈（PTA）为至少在相邻的2个频率听力下降20dB的感音神经性听力损失，排除遗传性聋、老年性聋、噪音性聋、中毒性聋、自身免疫相关性耳聋，以及其他中耳疾病导致的耳聋，所有患者均行MRI检查以排除听神经瘤。对照组入选的标准为：年龄＜80岁，既往无慢性中耳疾病、听力下降的病史。根据听力受损所累及的频率和程度，将突发性聋分为以下四种类型：低频下降型（≤1000Hz，听力受损≥20dBHL）；高频下降型（≥2000Hz，听力受损≥20dBHL）；平坦下降型（所有频率听力均下降，平均听阈≤80dBHL）；全聋型：（所有频率听力均下降，且平均听阈≥80dBHL）。

1.2标本采集及DNA提取

EDTA抗凝管采集所有研究对象外周静脉血2ml，利用全组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，保存于-80℃冰箱备用。

1.3ICAM-1 469K/E基因分型的测定

利用PCR-RFLP检测其多态性，PCR引物序列如下：上游：5'-AGGATGGCACTTTCCCACT-3'，下游：5'-GGCTCACTCACAGAGCACAT-3'。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，68℃退火45s，72℃延伸60s，共20个循环，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共20个循环，最后72℃延伸7min。扩增产物经BstUI酶限制性酶切后进行琼脂凝胶电泳，结果见图1。通过直接测序法对PCR扩增产物进行测序验证，测序反应由上海生工完成。

1.4统计分析

利用SPSS19.0进行统计分析，两组间连续变量的比较采用独立样本t检验，Hardy-Weinberg平衡符合程度、基因分型采用卡方检验。多因素回归分析校正混杂因素对基因多态性与突聋相关性造成的影响。

图1.M：DNA梯状标记；3、6：KK纯合基因型；1、4、5和7：KE杂合基因型；2、8：EE纯合基因型

2　结果

2.1研究对象临床特征

本研究选取了≥18岁的240名研究对象，其中75例突发性聋病例（男39人，女36人），165名对照者（男86人，女79人）。所有研究对象的人口学特征以及生活习惯相关疾病的统计情况见表1。两组间性别、糖尿病以及高脂血症差异无统计学意义。病例组年龄和高血压的发病率高于对照组，差异有统计学意义。

2.2ICAM-1 469K/E基因多态分布情况

ICAM-1 469K/E基因多态分布频率符合Hardy-Weinberg平衡定律。各基因型和等位基因在两组中的分布情况见表2。病例组中KK基因型（44%）低于对照组（55.8%），而携带E等位基因的KE+EE基因型频率（56%）高于对照组（44.2%），但差异无统计学意义（P=0.229）。在等位基因分布中发现，病例组K等位基因（64%）低于对照组（72.1%），而E等位基因频率（36%）则高于对照组（27.9%），然而等位基因分布差异仍无显著的统计学意义（P=0.073）。为探讨ICAM-1 469K/E基因多态性在不同的听力下降类型是否存在差异，我们进一步分析了ICAM-1 469K/ E基因多态性在不同听力类型中的分布情况。结果示在低频听力下降的突聋患者中，KK基因型高于携带E等位基因的KE+EE基因型，携带的K等位基因明显高于E等位基因，且差异有统计学意义。在平坦下降型中结果与之相反，携带E等位基因的KE+ EE基因型高于KK基因型，E等位基因高于K等位基因，差异均具有统计学意义（P＜0.05），此外听力平坦下降型携带的E等位基因高于其他听力下降类型。

表1　病例组和对照组临床基本特征

表2　两组ICAM-1 469K/E各基因型和等位基因分布频率

2.3多因素logistic回归分析

在三种遗传模型中，对性别、年龄、高血压、高脂血症、糖尿病进行调整（详见表4）。通过logistic分析发现，调整前显性遗传模型P值接近0.05，但在调整后P值增大，在调整前后三种模型的ORs均无显著的统计学意义。

3　讨论

ICAM-1是一种跨膜单链糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族中的一员，在白细胞、成纤维细胞及上皮细胞等多种细胞中均有表达［16］。存在于白细胞中ICAM-1是淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1：CD11a/CD18）和巨噬细胞抗原复合体（Mac-1：CD11b/CD18）的配体，在白细胞迁移和稳定细胞间粘附中发挥着重要作用。通过p38和ERK1/2MAPK信号通路，ICAM-1可诱导IL-1α、IL-1β、IL-6以及TNF-α等炎症因子的表达，促进炎症的发生发展［17］。ICAM-1作为重要的炎症标志物，通过促进白细胞浸润和粘附于血管内皮，参与动脉粥样硬化的形成。研究发现，ICAM-1的含量在心绞痛发作后10h内显著升高，并在随后的6个月内呈逐渐上升趋势［18］。Hajilooi等［19］研究发现，与健康对照者相比较，冠心病患者血浆中sICAM-1的含量显著升高（p＜0.04），并通过多因素logistic回归分析表明sICAM-1是冠心病发病的独立危险因素。

表3　各基因型和等位基因在病例组四种听力下降类型中的分布情况

编码人类ICAM-1的基因位于19号染色体p13.2-p13.3，由7个外显子、6个内含子、2、4kb的上游序列以及1.5kb的3'非编码序列组成，在第4外显子241位点、第6外显子469位点各存在一个功能性多态位点［20］。但因ICAM-1 241G/R基因多态性在中国汉族人群中较罕见［21］，所以我们选择了ICAM-1 469K/E作为研究对象。我们分析了75例突聋患者和165例对照者的ICAM-1基因多态性，发现病例组中携带E等位基因的基因型，以及E等位基因分布频率高于对照组，但差异均无统计学意义。在三种遗传模型中，利用多因素logistic回归分析以校正年龄、性别等因素对ICAM-1 469K/E基因多态性与突聋相关性造成的影响，但调整前后ORs均无统计学意义，表明ICAM-1 469K/E基因多态性不是突聋发病的危险因素。但在不同听力下降类型中ICAM-1 469K/E基因多态性分布频率存在差异，病例组E等位基因的分布频率，听力平坦下降型高于其他听力下降类型，且平坦下降型突聋患者携带的E等位基因显著高于K等位基因，差异有统计学意义。目前认为不同的听力类型可能存在不同的发病机制，听力平坦下降型与血管纹功能障碍或内耳血管痉挛相关［1］。ICAM-1 469K/E基因多态性在平坦下降型的分布情况提示，E等位基因可能是引起内耳微循环及血管纹功能障碍的危险因素。携带E等位基因可能使ICAM-1含量或者结构发生改变，级联放大炎症反应，损伤血管内皮，引起微循环障碍。本研究为明确ICAM-1 469K/E基因多态性与突聋是否存在相关性提供了参考依据，基因多态性分布存在种族和地域差异，ICAM-1469K/E基因多态性与突聋的相关性的研究在不同人种、不同地区可能会出现不一样的结果。因此，因此，对于明确ICAM-1 469K/E基因多态性与突聋是否存在相关性，以及携带E等位基因是否成为血管纹功能障碍或内耳血管痉挛的高危因素，仍需进行多中心、多种群、大样本的研究。

表4　ICAM-1 469K/E与突聋相关性的ORs和95%CI

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Association of ICAM-1 gene polymorphism with sudden sensorineural hearing loss

ZHANG Fang，TIAN Guangyong，HUANG Zhongxi，DUAN Yongchang，YANG Jingya，TANG Ling
1 Department of Otorhinolaryngology，Third Affiliated Hospital of Southern Medical University 2 Institute of Oncology，Basic Medical Sciences College of Southern Medical University. 3 Department of Library，Third Affiliated Hospital of Southern Medical University Corresponding author：TIAN GuangyongEmail：782683004@qq.com

Objective To determine the relationship between the 469K/E polymorphism(rs5498)of the ICAM-1 gene and sudden sensorineural hearing loss.Methods Subjects used in this study were derived from the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University.Two milliliters of venous blood were obtained from each participant for genomic DNA extraction.Detection of SNPs rs5498 was performed by polymerase chain reaction(PCR),followed by restriction fragment length polymorphism(RFLP)analysis.The restriction enzyme-digested PCR products were analyzed by 2%agarose gel electrophoresis.The Chi-square test was used to compare the frequency of alleles and genotypes between case and control groups.Results Seventy-five SSNHL patients(39 male and 36 female patients)were compared with 165 controls(86 male and 79 female subjects)enrolled in this study from June 2014 to July 2015.No significant differences in ICAM-1 469K/E genotype and allele frequencies were found between the SSNHL group and controls.However,there were significant differences in ICAM-1 469K/E polymorphism between patients with different types of hearing loss.Conclusion Our study results do not show significant association between 469K/E polymorphism of the ICAM-1 gene and sudden sensorineural hearing loss.The E allele may influence the susceptibility to the development of flat type of hearing loss.

sudden sensorineural hearing loss；ICAM-1；polymorphism.

R764.437

A

1672-2922（2015）04-726-4

2015-10-9审核人：郭维维）

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.04.039

张芳，硕士，研究方向：耳科学

田广永，Email：782683004@qq.com