基因治疗技术的发展在耳聋功能及治疗研究方面的应用

蒋刈　籍灵超　李北成　戴朴　韩东一*解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科（北京00480）2福建医科大学省立临床医学系、福建省立医院耳鼻咽喉科（福州35000）

·综述·

基因治疗技术的发展在耳聋功能及治疗研究方面的应用

蒋刈1、2籍灵超1李北成1戴朴1韩东一1*
1解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科（北京100480）
2福建医科大学省立临床医学系、福建省立医院耳鼻咽喉科（福州350001）

基因治疗是指将外界正常或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，从而改善疾病的一种治疗手段。基因治疗的概念最早是在1972年由Friedmann和Roblin提出［1］。既往以同源重组（Homologous Recombination，HR）修复机制为基础的基因打靶（gene targeting）技术在研究基因功能方面发挥重要作用并用于基因治疗的探索。近几年基于同源重组修复机制和不依赖于同源重组的非同源末端连接（Non Homologous End Joining，NHEJ）机制的基因组编辑（genome editing）技术开创了基因研究及治疗的新天地。

1　基因打靶技术的发展

基因打靶是应用同源重组的原理，在胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）技术基础上发展起来的，将外源性DNA定点修饰改造染色体目的基因的方法，包括基因敲除（knock out）和基因敲入（knock in）技术。基因打靶后定向改变细胞或者生物个体遗传信息并使修饰后的遗传信息通过生殖系遗传，表达突变的性状，已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。

20世纪70年代在酿酒酵母中得以应用的基因敲除技术［2］和20世纪80年代早期建立的胚胎干细胞技术［3］为基因打靶提供了基础。1985年，Smithies等［4］首次在哺乳动物细胞中进行的基因打靶，将一段外源质粒利用同源重组技术插入到人染色体的β-球蛋白位点基因间。1987年，Smithies［5］和Capecchi MR［6］两个研究小组同时报道在小鼠ES细胞中进行基因敲除。此后，基因敲除的小鼠ES细胞研究蓬勃发展，现已成为研究基因结构功能和建立人遗传性疾病模型的一种常规实验方法。1981年Sternberg从Pl噬菌体中发现Cre-LoxP系统，1994年，Zimmer等［7］首次应用Cre-LoxP系统研制的组织特异性基因敲除小鼠问世以后，条件基因敲除技术迅速取代了传统的完全基因敲除而成为主流［8］。条件基因敲除技术利用Cre-LoxP系统和FLP-FRT系统，用在特定阶段特定组织或细胞中表达Cre或FLP重组酶的转基因小鼠与在基因组中引入LoxP或FRT序列的小鼠交配，可导致子代鼠中特定组织或细胞中的靶基因删除。基因打靶多用于小鼠ES细胞研究，所建立的小鼠模型包括癌基因和肿瘤抑制基因、免疫相关基因、生长因子与受体基因等［9-13］，多与人类遗传性疾病有关。

体细胞克隆技术的发展使得利用克隆技术生产转基因动物成为科学家们研究的热点。1997年，Schnieke等［14］首次将凝血因子Ⅸ基因用脂质体包埋法转染胚胎成纤维细胞，筛选的阳性细胞进行核移植，获得转基因克隆羊“Polly”，是这项技术的标志。之后通过核移植生产的体细胞基因打靶绵羊［15］、敲除α-1，3-半乳糖苷酶基因的克隆猪［16］都获得了成功。2007年10月8日，美国科学家Mano R.Capecchi，Oliver Smithies和英国科学家Martin J.Evans因为在“基因打靶技术”方面的奠基性贡献分享了该年度诺贝尔生理学或医学奖。2007年，日本科学家利用脸部细胞［17］和美国科学家利用新生儿包皮细胞［18］均成功制成了诱导多能干细胞（iPS），被《自然》和《科学》分别评为2007年第一和第二大科学进步。

随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷多已经解决，但始终存在着难以克服的缺点：即基因功能与表型分离和基因敲除致死性，导致无法对这些相应的基因进行研究［19］。

2　基因打靶技术在遗传性耳聋基因功能研究及治疗方面运用

基于同源重组技术和胚胎干细胞技术基础上发展起来的基因打靶、条件基因敲除和体细胞克隆技术，已广泛运用于内耳发育及内耳基因功能研究中，这些基因主要是通过编码转录因子、生长因子、离子转运通道或神经递质受体蛋白等重要的生物分子调控内耳发育［20-36］。（见表2、表3）

表2　基因打靶与部分内耳相关基因功能研究

在耳聋基因治疗领域，1996年，Lalwani等［37］将遗传物质直接导入外周听系，开启了对感音神经性耳聋基因治疗的探索。2005年，Sage等［38］通过在RB1基因条件敲除小鼠内耳重新恢复RB1基因功能获得功能性毛细胞的再生。同年，Izumikawa等［39］利用腺病毒载体将Atoh1基因导入药物性致聋豚鼠内耳，观察其听力得到改善，受损的部分毛细胞得到恢复甚或产生新的毛细胞。2012年，Lustic等［40］通过腺病毒载体介导基因转染技术使Vglut3基因敲除小鼠恢复听力。2013年，Lentz等［41］利用纠正前体mRNA剪接缺陷的反义寡核苷酸（ASO）对新出生的Usher综合征小鼠模型进行经腹腔注射，使小鼠低频听力提高、前庭功能改善。但ASO治疗策略只在发育早期阶段（P5-P10）有效，并且效果短暂，限制了它在人类的应用。2014年，Yu等［42］通过直接注射方式，将外源性Gjb2基因导入Gjb2基因敲除的小鼠模型后发现该基因编码的Cx26表达于内耳支持细胞系统，缝隙连接通道形成，但模型小鼠的听力没有改善。2015年，Charles Askew等［43］运用腺相关病毒载体对Tmc1基因缺失小鼠进行治疗，在隐性遗传耳聋小鼠模型中检测到声音刺激下毛细胞电流感知，在显性遗传小鼠模型中部分恢复小鼠功能并持续2个月。这是基因治疗遗传性耳聋方面的重大突破，然而研究手段制备动物模型周期长、效率低、有不同程度细胞致死性以及不可预知的脱靶情况，仍然限制了科学家们在探索基因型和表型关系的科研道路上前进的步伐［44］。安全和有效的基因治疗手段来实现基因缺陷性小鼠模型的听功能修复是研究者探寻的目标。

3　基因技术新进展--基因组编辑技术

近年来兴起了新一代基因组编辑技术，包括：锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）、转录激活子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和成簇可调控间隔短回文重复RNA引导核酸酶（clustered regulatory interspaced shortpalindromicrepeatsCRISPR/Cas-based RNA-guided DNA endonucleases，CRISPR/Cas）。从分子生物学角度上说此三项技术均属于基因定点修饰技术，本质上均利用依赖于同源重组（HR）的修复机制和不依赖于同源重组的非同源末端连接（NHEJ）机制，联合特异DNA靶向识别及核酸内切酶完成DNA序列改变。新一代基因组编辑技术可实现基因组任意位置的基因敲除（knock out）、删除（deletion）或外源基因敲入（knock in）、基因融合（gene integration），进行生物基因组改造、基因功能分析、动植物育种抗病研究。此类技术以高效率、高精确度对基因组进行人工修饰，对目的基因组操作的效率较同源重组技术有明显的提高，敲除效果更加彻底，并且降低了脱靶情况［45，46］。

ZFNs技术和TALENs技术均是通过与Fok I非特异性核酸内切酶结构域形成异源二聚体完成特定位点剪切。因不需要通过ES细胞打靶环节，可以直接通过原核注射的方式实现目的基因的编辑，极大的缩短了建立基因敲除动物模型的时间，拓宽了基因修饰的物种范围。主要不同是构建靶点识别模块方式：ZFNs技术由特异性识别序列的锌指DNA结合域和Fok I切割结构域两部分组成的蛋白核酸酶实现内源基因的定点修饰。锌指DNA结合域部分一般包含3个重复的独立锌指结构，每个锌指能够识别3个碱基因，一个锌指DNA结合域可以识别9bp长度的特异性序列，而ZFN二聚体包含6个锌指，可以识别18bp长度特异序列。因ZFN技术实现了人类培养细胞系中ZFN介导的基因敲除［47］和基因定点敲入［48］。被《科学》杂志评为2009年生命科学领域十大创新技术之一。TALENs技术是根据目标DNA序列构建一对TAL靶点识别模块与N端的核定位序列、C端的Fok I酶连接，得到完整的TALEN元件。天然的TALEN元件识别的特异性DNA序列长度一般为17-18bp，而人工TALEN元件识别的特异性DNA序列长度一般为14-20bp。TALEN最少可识别1个碱基数量。TALEN技术自从2009年Moscou等［49］破解了Tale蛋白能够特异性识别和结合宿主DNA的作用机制及2011年Cermak［50］进行人工Tale蛋白的改造后，已经逐渐成为基因组定点靶向修饰的主要技术，开启人类多功能干细胞进行定向的基因操作探索，《科学》杂志在2012年度评论中将TALEN技术比作基因组的“巡航导弹”。

表3　基因打靶与部分综合征性耳聋基因功能研究

CRISPR/Cas系统［51］由Cas蛋白基因、前导序列和主体CRISPR基因座共同构成。根据作用机制中Cas蛋白基因的差异性将CRISPR系统分为3种类型，在II型CRISPR系统中，主要利用Cas9：sgRNA复合体作为基因组编辑工具。其中Cas9蛋白具有核酸内切酶功能，sgRNA（Single guide RNA）嵌合体由三部分组成：一段回文序列形成的发卡结构为Cas9蛋白的结合位点，由crRNA-tracRNA改造而成，一段长度约为12-20bp与目标DNA互补的RNA单链序列（basepairing region）以及一段终止序列（terminator）。crRNA（CRISPR RNA）通过碱基对连接反式编码小RNA（trans-encoded small RNA，tracrRNA）形成的二元RNA结构能指导Cas9蛋白对几乎所有DNA序列进行剪切。与ZFN和TALENs相比，CRISPR-Cas9在操作的简便性、实验周期、效率等方面更有优势，具体表现在①无物种限制，靶向精确性更高，可实现对靶基因多个位点同时敲除；②使用方便，费用低廉；③CRISPR/Cas系统只需改变很短的RNA序列（不超过100bp）就可实现不同位点的特异性识别，可避免超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症［52］。2013年多篇关于利用CRISPR-Cas9系统在多种动植物内［53-56］进行多重基因组重组编辑的报道，开启了第三代人工核酸酶成为研究热点的新篇章，而《Nature》将通过CRISPR/Cas9技术获得世界首例基因敲除食蟹猴的成果，称为人类疾病模型发展的里程碑［57］。

4　基因组编辑技术在遗传性耳聋基因功能研究及治疗方面运用

目前基因组编辑技术在内耳基因功能研究方面开展刚刚起步，2014年，Nagel-Wolfrum等［58］在研究Usher综合征的p.R31X基因突变中，运用ZFN技术将病变处双链断裂，重组正常的基因片段修复病变。2015年，Francis等［59］运用CRISPR/Cas9技术改变了Xin-actin binding repeat containing（XIRP2）表达，导致小鼠高频听力下降，并发现XIRP2在静纤毛长期功能保持中发挥作用。由于基因组编辑技术可用于生殖细胞、内耳毛细胞和支持细胞的研究，2015年，Zuris等［60］在Atoh1-GFP转基因小鼠耳蜗调控Atoh1功能使外毛细胞高表达GFP，利用阳离子脂质转运系统RNAiMAX/Lipofectamine将具有靶向基因修饰作用Cas9：sRNA直接注入小鼠耳蜗后，在原表达GFP的外毛细胞出现明显的GFP缺失。这是首次运用CRISPR/cas9技术把蛋白质-RNA复合体直接成功地传递到哺乳动物组织体内并实现的基因组编辑的重大事件，证实这项技术可用于遗传性听力损失小鼠模型听力恢复，是从基因水平纠正耳蜗局部致病突变的首次成功探索。

CRISPR/Cas技术在遗传性耳聋治疗方面应用潜力巨大。同时，在众多基因组编辑技术中，该技术优势明显，是遗传学研究领域的未来发展趋势。将CRISPR/Cas这一前沿技术应用于内耳研究，实现对遗传性耳聋基因的靶向编辑、纠正突变，将为耳聋治疗带来新的希望。

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R764.43

A

1672-2922（2015）04-750-5

2015-11-3审核人：郭维维）

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.04.045

国家自然基金重点项目（81230020）；国家自然基金面上项目（81371096）

蒋刈，博士，副主任医师，研究方向：耳科学及耳聋基因

韩东一，Email：hdy301@263.net