铜绿假单胞菌对萘和菲降解特性研究

汪如婷，雒晓芳*，田丹妮，莫芳芳，马麟龙

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730100；2.西北民族大学实验中心，甘肃兰州730100）

铜绿假单胞菌对萘和菲降解特性研究

汪如婷1，雒晓芳2*，田丹妮1，莫芳芳1，马麟龙1

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730100；2.西北民族大学实验中心，甘肃兰州730100）

研究不同pH和温度条件下，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）对多环芳烃中萘和菲的降解效果。结果表明，以活性炭为吸附载体，多环芳烃为唯一碳源，将此菌株培养48 h后，pH值为7.0时，萘的降解率可达25.68%，脱氢酶活性达到33.42（μg/mL）·h；菲的降解率可达41.9%，脱氢酶活性达到37.44（μg/mL）·h。当温度为37℃时，萘的降解率可达27.7%，脱氢酶活性达到33.60（μg/mL）·h；菲的降解率可达34.5%，脱氢酶活性达到39.96（μg/mL）·h。

铜绿假单胞菌；萘；菲；降解率；脱氢酶活性

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指由两个及两个以上苯环组合而成的一类稠环芳香族化合物，广泛存在于石油、煤炭中，属于持久性有机污染物，是世界上最早认识的一类化学致癌物。它具有远距离迁移性、难降解性和生物累积性［1］，以及潜在的致畸性、致癌性和基因毒性［2］，且其毒性随着PAHs苯环的增加而增加，其中的苯并芘是已知的具有极强致癌性的有机化合物。由于这类化合物具有极低的水溶性，在环境中很难消除，因此，PAHs被美国环保局和欧共体同时确定为必须要首先控制的污染物，并把其中的16种化合物作为环境污染的监测参数［3］。美国环保部（the United States environmental protection agency，USEPA）列出的优先控制污染物名单中包括16种多环芳烃，其中便包括萘（naphthalene，NAP）和菲（phenanthrene，PHE）［4］。多环芳烃包括自然和人为两个来源。自然来源形成的PAHs含量极微；而更主要的来源是人类生产和生活，如有机物燃烧、燃煤和炼焦工业等［5-6］。产生的多环芳烃会直接进入土壤或通过降雨、降雪和降尘进入土壤，这样土壤就成为环境中多环芳烃的储藏库和中转站，且承担了90%以上多环芳烃的环境负荷［7］。近年来，随着人类生产活动的加剧，使环境中的PAHs大量增加，破坏了其在环境中的平衡。因此，如何加快PAHs在环境中的降解，减少其对环境的污染，成为人们日益关注的话题。

近年来，已分离到的PAHs降解菌主要有假单胞菌属（Pseudomonas）、红球菌属（Rhodococcus）、黄杆菌属（Flavobacterium）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、诺卡氏菌属（No-cardia）、芽孢杆菌属（Bacillus）、微球菌属（Micrococcus）等［8-11］。虽然PAHs降解菌几乎在各个菌属中都有分布，但是目前的研究表明，不同的细菌对不同的PAHs的降解能力存在着很大的差别，假单胞菌是目前发现的降解菌种类最多、降解范围最广的菌属，已发现的假单胞菌可以降解几乎所有的四环以下的PAHs［3］。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）原称绿脓杆菌，是假单胞菌科假单胞菌属，是一种常见的革兰阴性杆菌，在环境中分布广泛，具有极强的环境适应能力。韩妍等［2］研究表明铜绿假单胞菌可以以萘等多环芳烃作为唯一碳源来维持菌体的生长。

本实验主要研究铜绿假单胞菌对萘、菲的降解作用，以铜绿假单胞菌对萘、菲的降解率和脱氢酶活性为评价指标，考察不同pH值和温度对菌株降解萘、菲的影响，掌握铜绿假单胞菌对萘、菲的最佳降解条件，为微生物降解多环芳烃的实际应用提供理论依据，对提高多环芳烃污染物的降解效率、促进多环芳烃处理技术的发展，具有十分重要的意义。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种来源

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是由西北民族大学实验中心微生物实验室分离纯化而得。

1.1.2试剂

萘、菲、氢氧化钠（NaOH）、盐酸（HCl）、环己烷、活性炭（均为分析纯），氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）：烟台市双双化工有限公司。

1.1.3培养基

营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、无机盐培养基：杭州微生物试剂有限公司。

1.2仪器与设备

SSW-CJ-ZF超净工作台、HH.B11.600-BS-Ⅱ电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；ZWY-200D全温振荡培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；HVE-50全自动高压灭菌器：日本株式会社平山制作所；ES-300E电子天平：长沙湘平科技发展有限公司；HH-8数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；UV2300紫外分光光度计：上海天美科学仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1菌种活化和样品的制备

将菌种在营养肉汤培养基中37℃培养48 h，得到的种子液于4000r/min离心3min，弃上清。用无机盐培养基洗涤下层菌体3次，洗涤完毕后用无机盐培养基制成菌悬液。

样品的制备：取若干50 mL锥形瓶，分别加入10 g活性炭，按活性炭质量比（5%）加入萘或菲，加入适量环己烷溶液溶解，放于超净台中待环己烷完全挥发。

1.3.2不同pH下铜绿假单胞菌（PA）对萘、菲的降解

取适量菌悬液，分成6份，在超净台中用1 mol/L HCL和1 mol/L NaOH溶液分别调整菌悬液的pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，各取15 mL调节pH后的菌悬液加入到对应的三角瓶中，每种物质设3个重复组。混合均匀后置于37℃恒温振荡培养48 h，按1.3.4及1.3.5的步骤测定其降解率和脱氢酶活性。

1.3.3不同温度下铜绿假单胞菌（PA）对萘、菲的降解

取若干已加好萘或菲的锥形瓶，在超净台中取15 mL原菌液加入到对应的锥形瓶中，每种物质设3个重复组。混合均匀后分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃恒温振荡培养48 h，按1.3.4及1.3.5的步骤测定其降解率和脱氢酶活性。

1.3.4萘、菲标准曲线的绘制及降解率测定

用环己烷分别准确配制质量浓度梯度为0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L、0.04 g/L、0.05 g/L的萘、菲标准溶液，以环己烷为对照，分别于波长268 nm和293 nm处用紫外分光光度计下测定吸光度值，绘制出萘和菲的标准曲线［12］。

将剩余的样品经蒸馏提取48 h后，以环己烷为对照测定馏出液中多环芳烃类污染物的吸光度值，通过回归方程来计算萘和菲的残留量和降解率。萘和菲残留量和降解率的计算公式如下：

式中：y为吸光度值；V为馏出液体积，L。

式中：m为萘（菲）残留量，g；M为样品中原污染物的质量，g。

1.3.5TTC标准曲线的绘制及脱氢酶活性的测定

样品中脱氢酶活性的测定采用张清敏等［13］TTC分光光度法。通过把待测溶液离心后加入TTC和Tris-HCl溶液萃取后于波长486 nm处测定其吸光度值，根据绘制TTC标准曲线计算出土壤中脱氢酶活性。脱氢酶活性的计算公式如下：

式中：B为脱氢酶活性，（μg/mL）·h；x为TTC质量浓度，μg/mL；H为培养时间，h。

2　结果与分析

2.1TTC标准曲线

以TTC质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制TTC标准曲线，结果见图1。

图1　TTC标准曲线Fig.1 Standard curve of TTC

由图1可知，标准曲线线性回归方程为y=0.013x-0.010 2，相关系数R2=0.993 9，表明TTC质量浓度与吸光度值具有良好的线性关系。

2.2萘和菲的标准曲线

以萘、菲的质量浓度（x）为横坐标，不同质量浓度的萘、菲溶液对应的吸光度值（y）为纵坐标，绘制萘、菲标准曲线，结果见图2。

图2　萘（A）及菲（B）的标准曲线Fig.2 Standard curve of naphthalene（A）and phenanthrene（B）

由图2可知，萘的标准曲线线性回归方程为y=48.25x+ 0.017，相关系数R2=0.999 0；菲的标准曲线线性回归方程为y=71.52x+0.194，相关系数R2=0.985 0。结果表明萘和菲的含量与吸光度值均具有良好的线性关系。

2.3PA对萘、菲的降解率及脱氢酶活性的影响

2.3.1不同pH值条件下PA对萘、菲降解率的影响

图3不同pH值条件下铜绿假单胞菌对萘及菲降解率的影响Fig.3 Effect of different pH on degradation rate of naphthalene and phenanthrene byP.aeruginosa

图3为萘和菲在不同pH值条件下培养48 h后的降解率。由图3可知，pH值对多环芳烃的降解率具有较大的影响。当pH＜7.0时，萘和菲的降解率随之降低；当pH值为7.0时多环芳烃达到最高降解率，其中萘的降解率达到25.68%，菲的降解率达到41.9%。这是因为铜绿假单胞菌的最适生长pH值为7.0，所以在pH值为7.0时有较好的降解效果。当pH＞7.0时，随着pH的升高，降解率降低。因此，选择最佳pH 7.0为宜。

图4　在不同温度条件下铜绿假单胞菌对萘及菲降解率的影响Fig.4 Effect different temperature on degradation rate of naphthaleneand and phenanthrene byP.aeruginosa

2.3.2不同温度条件下PA对萘、菲降解率的影响

图4为萘和菲在不同温度条件下培养48 h后的降解率。由图4可知，温度对铜绿假单胞菌降解多环芳烃具有较大的影响。随着培养温度的升高，萘和菲降解均上升。25℃时萘的降解率仅为17.58%，菲的降解率为19.44%。随着温度的升高，降解率上升速率逐渐提高，当温度为37℃时，萘和菲的降解率达到最高值，分别为27.7%和34.5%；37℃之后多环芳烃的降解率开始迅速下降，这可能是因为铜绿假单胞菌的最适生长温度为37℃，在41℃也能生长，这是铜绿假单胞菌的显著特点［14］。因此，选择最佳温度37℃为宜。

2.3.3不同pH条件下PA降解萘、菲产脱氢酶活性的影响

图5　在不同pH值条件下铜绿假单胞菌对萘及菲脱氢酶活性的影响Fig.5 Effect of different pH on dehydrogenase activity of naphthalene and phenanthrene byP.aeruginosa degradation

图5为萘和菲在不同pH值条件下脱氢酶活性的变化。结合图3可以看出，脱氢酶活性与降解率变化趋势基本相同，脱氢酶活性与降解率之间可能存在一定相关性。在多环芳烃的降解过程中脱氢酶使多环芳烃的氢原子活化并传递给特定的受氢体，实现多环芳烃的氧化和转化［15-16］。脱氢酶活性的提高表明微生物生物活动频繁，有利于多环芳烃的生物降解。由图5可知，在pH为4.0～7.0时，脱氢酶活性的升高趋势较为明显，同时降解率的增加也有明显变化；当pH值为7.0时，二者的脱氢酶活性均达到最高值，分别为34.32（μg/mL）·h和37.44（μg/mL）·h；pH＞7.0时，脱氢酶活性迅速下降。因此，选择最佳pH值7.0为宜。

2.3.4不同温度条件下PA降解萘、菲产脱氢酶活性的影响

图6在不同温度条件下铜绿假单胞菌对萘及菲脱氢酶活性的影响Fig.6 Effect of different temperature on dehydrogenase activity of naphthalene and phenanthrene by P.aeruginosadegradation

图6为萘和菲在不同温度条件下脱氢酶活性的变化。结合图4可以看出，脱氢酶活性曲线与降解率曲线趋势基本相同，脱氢酶活性与降解率之间可能存在一定相关性。由图6可知，当温度为25～35℃时，脱氢酶活性的升高趋势较为明显，与降解率的升高趋势相同；当温度为37℃时，二者脱氢酶活性均达到最高值，分别为33.60（μg/mL）·h和36.96（μg/mL）·h；当温度＞37℃时，二者的脱氢酶活性均为下降趋势，结合图4可以看出，与降解率降解曲线的趋势也基本相同。这可能是低温下由于酶活性的降低使PAHs的生物降解受到抑制。在30～40℃范围内，高温可以提高PAHs代谢率达到最大值。但超过这个温度范围，PAHs的膜毒性会增高［17］。因此，选择最佳温度37℃为宜。

3　结论

以铜绿假单胞菌为研究对象，初步探讨了不同pH值和温度下此菌株对多环芳烃中萘和菲的降解效果和脱氢酶活性的影响。结果表明，以活性炭为吸附载体，多环芳烃为唯一碳源，将此菌株培养48 h后，pH值为7.0时，萘的降解率可达25.68%，脱氢酶活性达到33.42（μg/mL）·h，菲的降解率可达到41.9%，脱氢酶活性达到37.44（μg/mL）·h。当温度为37℃时，萘的降解率可达27.7%，脱氢酶活性达到33.60（μg/mL）·h，菲的降解率可达34.5%，脱氢酶活性达到39.96（μg/mL）·h。可见，pH值、温度均对萘菲的降解均有较大的影响，选择合适的降解条件，提高了萘、菲等多环芳烃污染物的降解率和脱氢酶活性，可对进一步研究萘菲等多环芳烃污染物的降解提供参考依据。

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Research on the degradation characteristics of naphthalene and phenanthrene byPseudomonas aeruginosa

WANG Ruting1，LUO Xiaofang2*，TIAN Danni1，MO Fangfang1，MA Linlong1
（1.Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730100，China；2.Center of Experiment，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730100，China）

The effect ofPseudomonas aeruginosaon naphthalene and phenanthrene degradation was studied under the condition of different pH and temperature.The results showed that using activated carbon as carrier，polycyclic aromatic hydrocarbons as sole carbon source，when the strain was cultured for 48 h at pH 7，the degradation rate of naphthalene was 25.68%，the dehydrogenase activity reached 33.42（μg/ml）·h，the degradation rate of phenanthrene reached 41.9%，and the dehydrogenase activity reached 37.44（μg/ml）·h.When the temperature was 37℃，the degradation rate of naphthalene was27.7%，the dehydrogenase activityreached 33.60（μg/ml）·h，the degradation rate of phenanthrene was 34.5%，and the dehydrogenase activity reached 39.96（μg/ml）·h.

Pseudomonas aeruginosa；naphthalene；phenanthrene；degradation rate；dehydrogenase activity

Q935

A

0254-5071（2015）10-0082-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.018

2015-09-01

西北民族大学2015年大学生创新创业训练计划项目（201510742079）；西北民族大学2015年本科生科研创新项目（URIP15166）

汪如婷（1994-），女，本科生。研究方向为环境微生物。

雒晓芳（1980-），女，副教授，硕士，研究方向为环境微生物。