超临界CO2流体色谱分离2，4-二叔丁基酚和2，6-二叔丁基酚

周旭珍，饶桂维，李成平，活　泼（浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江　杭州　310015）

超临界CO2流体色谱分离2，4-二叔丁基酚和2，6-二叔丁基酚

周旭珍，饶桂维，李成平，活泼*
（浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州310015）

采用超临界CO2流体色谱分离酚类同分异构体化合物：2，4-二叔丁基酚和2，6-二叔丁基酚。通过单因素法考察了色谱柱类型、改性剂种类、改性剂浓度、色谱柱温、背压对容量因子和分离度的影响，确定了较佳的分离条件：色谱柱Sepax SFC-Pyridine（250 mm× 4.6 mm，I.D.5 μm）；流动相:V（CO2）:V（乙醇）=90：10；流速：3 mL/min；柱温：35℃；背压：100 bar；紫外检测波长：270 nm；进样量：30 μL浓度为1.0 mg/mL的2，4-二叔丁基酚和2，6-二叔丁基酚的甲醇溶液，此时，分离时间在5 min以内，分离度达到4.68。

超临界CO2流体色谱；2，4-二叔丁基酚；2，6-二叔丁基酚

超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography，SFC）是新近发展起来的一种色谱分离方法［1-2］。通常以超临界CO2流体作为流动相，以固体吸附剂（如硅胶）或键和到载体上的高聚物为固定相。与常规的HPLC、GC技术相比，具有低粘度、高扩散和高传质速率等特点，超临界流体介于气体和液体之间的性质，即可用于分析GC不适用的高沸点及热不稳定样品，也可以测定液相中非极性化合物，如脂肪酸类，倍半萜类等。此外，SFC主要采用二氧化碳作为流动相，具有化学稳定、不易燃、低毒和低污染的特点，且二氧化碳价格比有机溶剂低，因此SFC为一种低碳环保的分离分析技术［3-5］。2，4-二叔丁基酚、2，6-二叔丁基酚均为酚类化学物质，这两种酚在制药、化纤和橡胶行业上广泛地被作为中间媒介，在制备抗氧化剂、抗紫外剂上有广泛的应用。含酚类的废水是目前环保工作中的重点和难点，该类废水通常污染水源，毒死鱼虾，危害农作物，并进而危害人类的健康［6-9］。当前，国内外学者对此类化合物的分析测定主要采气相色谱法，液相色谱法、气质联用和液质联用等［10-12］。本课题组之前就采用高效液相色谱法对工业废水中的这两个酚类化合物进行了测定，但实验耗费大量有机溶剂，且两化合物出峰时间较长，完成分离需12 min，且两峰的分离度约为1.5，在复杂基质中较易被干扰［13］。本文尝试用超临界CO2流体色谱法对2，4-二叔丁基酚，2，6-二叔丁基酚2个同分异构体进行分离，通过考察改性剂种类及浓度、色谱柱温、背压对分离的影响，确定了较佳的超临界流体色谱条件。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

仪器：Investigator SFC System超临界流体色谱系统（WATERS），含超临界CO2流体泵和一个改性剂泵，柱温箱、2998PDA检测器；Sepax SFC-Pyridine柱（250 mm×4.6 mm，I.D.5 μm）；KQ-50B超声波清洗机，AB204-N电子天平。

试剂：2，4-二叔丁基酚（97%，aladdin公司）；2，6二叔丁基酚（98%，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙醇、乙腈和异丙醇（美国天地公司）；CO240 L钢瓶装（纯度99.99%，杭州新世纪混合气体有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1色谱条件

流动相为二氧化碳-甲醇、二氧化碳-乙醇、二氧化碳-乙腈及二氧化碳-异丙醇；检测波长：270 nm；进样量：30 μL；流速：3 mL/min；色谱柱温、背压、流动相组成见下述说明。

1.2.2对照品贮备溶液的制备

精密称取2，4二叔丁基酚和2，6二叔丁基酚对照品各100 mg，分别置于25mL容量瓶中，加入适量的甲醇溶解并稀释至刻度，充分摇匀；得到2，4二叔丁基酚和2，6二叔丁基酚的贮备溶液，质量浓度为4 mg/mL。

1.2.3对照品标准溶液的的配置

从已配置好的对照品贮备溶液各取25 mL于100 mL容量瓶中，加入适量的甲醇稀释至刻度线，充分摇匀，得到质量浓度为1 mg/mL的对照品标准混合溶液。

1.2.4容量因子k’及分离度Rs的计算

为了确定出较好的分离条件，不同改性剂、柱温、背压条件对2，4二叔丁基酚、2，6二叔丁基酚分离的容量因子k’和分离度Rs的影响［14-16］。为了区分2，4二叔丁基酚和2，6二叔丁基酚的容量因子，分别用k1’、k2’表示。k’和Rs的计算如下：

式中：tR为样品分子的保留时间。to为色谱柱的死时间。

式中：tR1、tR2分别为化合物的保留时间，W1、W2为所对应的色谱峰底宽。

2　结果与讨论

2.1色谱柱的选择

本文在流速为3 mL/min、背压为100 bar、柱温为35℃和改性剂为10%甲醇溶液时，采用Sepax SFC-Pyridine柱、Hypersil ODS2和ViridisTMSilica等色谱柱对该对化合物进行了分离。实验结果表明：在同等条件下，2，4二叔丁基酚和2，6二叔丁基酚在Hypersil ODS2和ViridisTM Silica色谱柱上未能完全分开，分离效果差，而在Sepax SFC-Pyridine柱上的分离效果较佳。因此选择Sepax SFC-Pyridine柱做进一步的优化研究。

2.2改性剂的影响

在SFC分离中，因采用CO2作为流动相，而CO2为非极性，对于分离弱极性及极性化合物调节余地不大，因此，常加入改性剂来调节流动相的极性。常见的改性剂有甲醇、乙醇、乙腈和异丙醇。改性剂的主要作用是改变流动相的极性，对超临界流体色谱的分离有重要影响。本实验在采用甲醇、乙醇、乙腈和异丙醇作为改性剂，每种改性剂调节范围设定为10%～25%，在流速为3 mL/ min、背压为100 bar、柱温为35℃的相同条件下进行分离时，乙腈作为改性剂分离效果最差，在体积比例分数为10%和25%时两峰未能分离，异丙醇分离效果比不上甲醇和乙醇，甲醇与乙醇的分离效果相当，但我们可以看到，乙醇体积分数在10%～25%变化时，两种物质的分离度几乎都在5以上，在10%和15%时达到了10以上。综合考虑选择性α和容量因子k，本研究选用10%乙醇作为改性剂。

表1　改性剂种类及浓度对2，4二叔丁基酚、2，6二叔丁基酚的容量因子、选择性和分离度的影响

2.3柱温的影响

柱温对分离的影响较为复杂，它综合了两方面的作用。一方面，随着柱温的升高，超临界流体的密度降低，样品分子的保留增强，容量因子增强；另一方面，随着柱温升高，样品分子传质速率增加，有助于固定相表面脱附进入流动相中，容量减小［17］。从表2可见，温度对该化合物的影响主要表现为前一方面。随着温度的升高，容量因子增加，但分离度减小。因此确定：在改性剂为10%乙醇、流速3.0 mL/min和背压为100 bar条件下，分离较佳的柱温是 308 K，此时的分离度为4.679。

表2　柱上容量因子、选择性和分离度随柱温的变化

2.4背压的影响

除了改性剂和柱温外，背压是影响超临界流体色谱分离的另一个重要因素。在改性剂为10%乙醇、柱温是308 K和流速3.0 mL/min的条件下，容量因子、选择性和分离度变化如表3所示。

表3　柱上容量因子、选择性和分离度随背压的变化

由表3可见，背压升高，在改性剂为10%乙醇、柱温是308 K和流速3.0 mL/min的条件下，分离效果最好的是100 bar，此时分离度为4.679。

3　结论

本实验在考察了色谱柱种类、改性剂、流动相组成、柱温和背压对分离2，4二叔丁基酚和2，6二叔丁基酚的影响，最终确定超临界流体色谱最佳的分离条件：以Sepax SFC-Pyridine（250 mm ×4.6 mm，I.D.5μm）为色谱柱、改性剂为10%乙醇，流动相流速3.0 mL/min，柱温 308 K，背压100 bar，进样30 μL，在此条件下，两化合物的分离度可达4.679。该方法可应用于环境及食品中2，4二叔丁基酚，2，6二叔丁基酚的快速检测，样品运行时间短，改性剂用量少且无毒。

图1　2，4二叔丁基酚和2，6二叔丁基酚的超临界流体色谱图Fig.1 Figure title in English Supercritical CO2fiuid chromatogram of 2，4-Ditertbutyl phenol and 2，6-Ditertbutyl phenol

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Separation of 2，4-Ditertbutyl phenol and 2，6-Ditertbutyl phenol by Supercritical CO2Fluid Chromatography

ZHOU Xu-zhen，RAO Gui-wei， LI Cheng-ping，HUO Po*
（College of Biology and Environmental Engineering，Zhejiang Shuren University，Hangzhou，Zhejiang 310015，China）

These isomers 2，4-ditertbutyl phenol and 2，6-ditertbutyl phenol have been separated by supercritical CO2fluid chromatography（SFC）.Orthogonal experiment design was adopted to optimize the method for chromatographic parameters including content of ethyl alcohol（EtOH）in mobile phase of CO2fluids，the type of column，the column temperature and the column pressure on the capacity factor（k‵）and resolution（Rs），and the best conditions for separation were optimizes as follows:using a Sepax SFC-Pyridine column（250 mm×4.6 mm，I.D.5 μm）；the mobile phase as CO2-EtOH（90:10，V/V）at the flow rate of 3 mL/min；the column temperature at 35℃；the column pressure at 100 bar；Uv detection wavelength was 270 nm；30 μL of sample solution injected at the concentration of 1mg/mL.Under these conditions，the separation time was about 5 min，with Rs at 4.68.

supercritical CO2fluid chromatography；2，4-ditertbutyl phenol；2，6-ditertbutyl phenol

1006-4184（2015）12-0048-04

2015-09-11

浙江省教育厅研究项目（Y201432429）；浙江省大学生科技创新活动计划项目（2014R420030）。

周旭珍（1993-），女，浙江遂昌人，从事色谱检测工作。E-mail:1197223381@qq.com。

活泼（1962-），博士，教授，研究方向：功能食品开发及检测。E-mail:xiankelaifeng@163.com。