新型淀粉基止血材料的制备及生物相容性研究

王艳玲，刘光万，吴丽娟，曲洪媛，赵芳，杨光，吴昌琳△

(1.华东师范大学物理系，上海磁共振重点实验室，上海 200062； 2.苏州博创同康生物工程有限公司，苏州 215347)

1 引 言

出血是战伤、外科手术和日常意外事故中常常遇到的问题，甚至危及人们的生命，因此，研究新型的快速、有效的止血材料一直是人们关注的话题[1-2]。对于血流量丰富、脆性大的实质性脏器如脑、肝脏、肾脏和脾脏等创面进行机械性止血易造成其组织损伤、针眼出血或裂口出血，严重的甚至影响器官的功能。

对此，国内外一直致力于研制对实质脏器创面迅速止血并且对其功能影响小、生物相容性好的止血材料。目前以分子筛吸水机理止血的血液因子浓缩类止血产品在临床上和军事上发挥重要的作用。如美国Z-Medica公司生产的QuikClot沸石基止血粉通过FDA的批准用于严重出血创伤的急救，然而其在使用时会产生超过100℃的高温，造成创面组织的损伤[3～5]。美国Medafor公司生产的“Arista”可吸收性淀粉止血微球，虽然具有很好的安全性及良好的止血效果，但价格昂贵并且作为体内止血材料，其粘附性、吸液性不够强，特别是表氯醇交联剂可能存在潜在的毒性[6]，因此，针对以上血液因子浓缩类止血材料存在的不足，本研究介绍一种新型淀粉基止血材料的制备及其性能研究。

2 材料与方法

2.1 实验材料及试剂

马铃薯淀粉，氢氧化钠，盐酸均由国药集团化学试剂有限公司提供；透明质酸由华熙福瑞达生物医药有限公司提供(山东)；三偏磷酸钠由亚科化学试剂有限公司提供(苏州)；Arista微球购自美国Medfor公司。

2.2 实验仪器

JJ-1型精密增力电动搅拌机，上海汗诺仪器有限公司；HH-5恒温水浴锅，金坛市瑞华仪器有限公司；DJ-V60A型电子天平，苏州江东精密仪器；PH168A酸度计，苏州英格泰电子科技有限公司；TDL-40B型离心机，上海安亭科学仪器厂；VFD2000G真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；Hitachi S-4800型电子扫描显微镜(日立)；Ultima IV X-射线粉末衍射仪，日本理学；DSC-6100差示扫描量热仪，Seiko Instruments。

2.3 新型淀粉基止血粉

2.3.1制备方法 (1)可溶性淀粉的糊化：称取一定量的淀粉并加入到蒸馏水中，加热搅拌得到均匀透明的淀粉溶液，静置待用。(2)交联反应：按照一定的比例将透明质酸和三偏磷酸钠加入到上述的淀粉溶液中。并加入氢氧化钠，使溶液的pH维持在碱性环境。恒温搅拌反应充分。(3)制备颗粒：加入盐酸中和。取乳白色液体用蒸馏水反复洗涤数次，将所得沉淀物冷冻干燥。冻干的样品粉碎成颗粒，保存待用。

2.3.2结构表征 (1)结构观察：用肉眼观察新型淀粉基止血颗粒的颜色及宏观结构状态；用电子扫描显微镜(SEM)观察颗粒的微观结构。(2)结构分析：材料反应前后的晶体结构测定用X-射线粉末衍射仪(XRD)，CuKα，40 kV×40 mA，扫描速度6°/min。

2.4 热稳定性

用差示扫描量热仪对实验样品进行热稳定分析。加热速率为10℃/min。

2.5 生物相容性研究

2.5.1皮肤刺激试验和致敏试验 根据刺激与迟发型超敏反应试验[7]，每只新西兰家兔分别有两个试验材料区域和两个对照材料区域，分别将一定量的新型淀粉基样品及对照组样品(Arista止血微球)浸提液注射于设置好的皮肤区域，在规定的时间内观察皮肤的红斑和红肿反应状况(每种样品分别用3只家兔)；致敏试验采用小白鼠，随机分为3组，每组3只。A组注射新型淀粉基止血材料浸提液，B组注射同等剂量的Arista止血微球浸提液，C组注射同等剂量的生理盐水，随后观察包块全身的反应及包块吸收所用时间。

2.5.2全身急性毒性试验 试验采用昆明种小鼠12只，体重18～22 g。随机分为2组，进食不禁水。试验组注射新型淀粉基止血颗粒的浸提液，对照组注射生理盐水。注射24、48和72 h后观察小鼠的体重、饮食、呼吸、运动、排便和皮肤黏膜等的变化。

2.5.3细胞毒性试验 试验采用L929成纤维细胞，细胞毒性试验按照国标GB/T 16886.5 MTT比色法进行。将制备好的细胞悬浮液接种于96孔培养板，并设阳性对照、阴性对照和空白对照，置于二氧化碳培养箱(37℃)培养24 h后除去上清液。阳性对照组加入阳性对照浸提液，阴性对照组加入阴性对照浸提液，空白对照组加入新鲜的细胞培养液，样品组加入新型淀粉基止血粉浸提液，继续培养72 h。然后在显微镜下观察细胞的形态，计算细胞相对增值率同时评定细胞毒性[8]。

3 结果

3.1 扫描电镜观察

从电镜照片可以看出，交联前样品(原淀粉)表面布满裂纹，但是几乎看不出有孔洞；而经过三偏磷酸钠交联工艺后，样品(磷酸化的淀粉-透明质酸)表面及其内部具有许多相连的孔，呈现出三维网络状结构。这一结构大大增加了止血颗粒的比表面积，并有助于吸收血液的液体成分，阻止血液的固形成分形成凝胶，从而促进止血。

图1 扫描电镜图片

3.2 X-射线衍射光谱分析

见图2。

图2 两种样品的X射线衍射图片Fig 1 XRD image of two samples

从图2中可以看出，原淀粉在2θ为18°处有强结晶峰，2θ在23°处有两个微弱的结晶峰；但随着交联反应的发生，2θ为18°的强结晶峰逐渐减弱，并且在23°处的两个弱结晶峰逐渐合并为一个。这表明原淀粉在交联的过程中，结晶性遭到一定程度的破坏，形成了更多的无定形区域。

3.3 热稳定性分析

由于结合水蒸发时所显示的吸热峰可以反映样品交联反应前后分子的变化，见图3。新型交联淀粉基样品在100℃左右的吸热峰面积明显大于原淀粉的吸热峰面积，表明该交联淀粉基样品中含有更高的结合水含量，由于少量透明质酸的加入可能有助于样品保持更多的水分[9]。另外，值得一提的是新型交联淀粉基样品的吸热峰温度区域较原淀粉大，这可以解释为交联反应在一定程度上提高了新型淀粉基样品的热稳定性。

3.4 生物相容性分析

3.4.1皮肤刺激试验 在新西兰家兔脊柱两侧的实验区域分别注射新型淀粉基样品和对照组样品的浸提液，并在24、48和72 h观察试验区域的皮肤反应情况。根据国家标准GB/T16886.10对皮肤反应程度的等级记分系统，新型淀粉基样品一侧和对照组样品试验侧皮肤均没有出现水肿、红斑等，并且新型淀粉基样品组和对照组的皮肤反应为0分。由此说明所制备样品没有皮内反应。

图3 两个样品的DSC曲线Fig 3 DSC curves of two sample

3.4.2致敏试验 新型淀粉基样品组与Arista微球组致敏试验表明试验小白鼠的精神正常，呼吸和运动也均正常，并且试验周围皮肤未见明显的水肿和红斑等致敏作用；但是阳性对照组的注射区域和周围皮肤均可见红斑。

3.4.3全身急性毒性试验 在注射样品浸提液和生理盐水后，新型淀粉基样品组、Arista微球组和生理盐水组的小白鼠在连续观察期间活动、临床表现正常，体重增幅也基本无差异，表明本研究所制备的新型淀粉基样品无全身急性毒性反应。

3.4.4细胞毒性试验 按照国家标准GB/T16886.5中规定的细胞毒性0 ～ 1级分级原则，阳性对照组为2级，阴性对照组为0级。本研究所制备的新型淀粉基止血材料的细胞毒性反应小于1级，因此符合临床使用要求。有文章表明一定量的透明质酸具有选择性调节成纤维细胞黏附和增殖的功能[10]，这也是该新型淀粉基止血材料优于其他止血材料的功能。

4 讨论

本研究以马铃薯淀粉为主要原料，加入少量透明质酸并通过三偏磷酸钠的交联工艺制备出的可完全降解吸收的多糖颗粒具有三维网状结构。该颗粒可迅速吸收血液中的水分，同时有效阻止血液中的固形成分(如止血因子、红细胞、血小板和纤维蛋白原等)形成凝胶；另外固形成分的凝聚加快了内源性凝血机制的启动，因此，该新型淀粉基止血材料具有非常好的止血功能。另外通过DSC热稳定性分析可知，新型淀粉基止血材料较原淀粉具有良好的热稳定性，有利于材料的加工，存储及使用。

止血材料必须经过一系列的实验验证具有良好生物相容性才能应用于临床。本研究按照国家标准GB/T16886医疗器械生物学评价系列展开了较全面的动物实验。实验结果表明：无皮内和致敏反应、无全身急性毒性反应、无细胞毒性，证明该新型淀粉基止血材料具有良好的生物相容性。

因此，此新型淀粉基止血材料是一种较为理想的止血材料，改进了现有止血材料的弊端，有望应用于临床实践中。