脐带间充质干细胞辅助游离脂肪的移植研究

顾伟，罗旋，匡勇△

(1.上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021；2.上海交通大学医学院附属仁济医院，上海 200001)

1 引 言

由于创伤、手术切除、先天畸形等原因导致的软组织缺损，采用组织移植以改善或恢复生理功能或外形是最重要的治疗手段。自体脂肪组织其生物相容性好，质地、外形自然而不存在免疫排斥反应，是软组织缺损修复的最理想材料。但脂肪移植术后往往在长期观察中出现脂肪细胞成活率低，移植物组织被吸收等问题。2007年Yoshimura[1]等报导了将脂肪干细胞与脂肪共同移植进行软组织填充，有效提高了成活率，并将这一技术命名为细胞辅助的脂肪移植(cell assisted lipotransfer, CAL)。其不足之处是，需要消耗更多的脂肪组织，以获得脂肪组织中的各种细胞(主要是脂肪间充质干细胞，血管内皮前体细胞和内皮细胞等)。而需要脂肪移植的患者，常不能提供足够的优质脂肪量。另外，脂肪细胞作为成体细胞随着患者年龄的增加其增殖分化能力不断下降[2]。为此，我们设计应用来源更加广泛，且无创的脐带间充质细胞来替代脂肪间充质细胞，对比研究脂肪干细胞和脐带间充质干细胞在辅助游离脂肪移植中的异同。

2 实验材料及方法

2.1 实验材料

本实验所涉及的脐带均来自上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科，由无任何基础疾病产妇提供，4名，25～34岁；脂肪组织来自上海交通大学仁济医院整形外科，由无任何基础疾病吸脂求美者提供，6名，27～43岁。所有提供者均知情同意。

本实验所用裸鼠均来自上海交通大学医学院附属仁济医院动物实验室，4周龄，雌性。

2.2 实验方法

我们设计应用脐带间充质干细胞与脂肪组织颗粒混合后，移植到裸鼠皮下，与单纯脂肪组织移植作对照，不同的时间观察其在改善组织缺损和转归及作用机制的异同。

取传至第3代的脐带间充质干细胞(1x106)制成80 ul稀薄悬液，与脂肪颗粒(0.5ml)混合为实验组，80 ul培养液与脂肪颗粒(0.5 ml)混合为对照组，在相同条件下移植于裸鼠皮下，经一周，一个月，两个月时间，取出移植物，观察大体吸收情况，测量移植物重量，血管生成情况，real-time PCR实验检测VEGF、PPAR-γ基因表达情况。

2.3 数据统计

本实验所有数据均采用统计软件SPSS17.0对其进行t检验分析，P<0.05为有统计学意义。

3 实验结果

3.1 动物实验结果

移植第一周后，两组间移植物的大小和重量没有明显改变。1个月时，两组移植物较1周时缩小，提示有部分被吸收，2个月时，两组移植物均明显被吸收(见图1A)。三个观测时间点重量的差异没有显著的统计学意义(见图1B)。

表1 脐带间充质干细胞辅助游离脂肪移植各组移植物重量(单位：g)

图1 移植物的大体观及重量

可见1周时两组移植物未见明显吸收，大体及重量相近；一个月时，脐带间充质干细胞组移植物重量略高，2个月时，对照组几乎全部吸收，脐带间充质干细胞组也有大部分被吸收，仅有少量存留。

Fig1Grossappearanceoftransplantatedtissues

There is no obvious change both in control and UCMSCs groups at 1week after transplantation. At 1month and 2months post-transplantation, UCMSCs supplemented grafts are a bit bigger than control group,and the weight are a little higher.

各组移植物取下后立即固定、包埋、切片、HE染色，观察组织内细胞成活及血管生成情况。见图2。

3.2 Real-time PCR分析

移植物中的VEGF、PPAR-γ基因表达水平通过real-time PCR技术进行检测，结果见图3。

图2 移植物组织切片的HE染色两组移植物脂肪组织改变差异不明显。物镜10倍放大。

图3 移植物中PPAR-γ、VEGF基因表达水平

三个观测时间点中，两组间PPAR-γ表达相同，而脐带间充质干细胞组VEGF表达较高。

Fig3Real-timePCRanalysisofthePPAR-γ，VEGFgeneexpression

The UCMSCs group have higher VEGF gene expression, while no difference between the two groups about PPAR-γexpression

各组移植物中的PPAR-γ基因表达显示，移植后1周，对照组与脐带间充质干细胞成脂转录因子PPAR-γ的表达基本相同，移植后1个月、2个月两组PPAR-γ基因表达也未见显著改变，两组间PPAR-γ基因表达水平之间差异无统计学意义(见图3A)。移植后1周，对照组与脐带间充质干细胞组VEGF基因表达水平均较低，无显著差异；在1个月和2个月时，两组VEGF表达维持在较低水平，无显著的改变，对照组与脐带间充质干细胞组差异无统计学意义(见图3B)。

4 讨论

脐带间充质干细胞是一种原始的间充质干细胞，可以在体外条件下稳定传代和冻存复苏，而不发生自发分化，且可以保持较强的增殖能力[3]。体外经化学试剂和生长因子作用后，可以分化为软骨、骨和脂肪等中胚层来源的细胞，而且可以转分化为神经元、胶质细胞和内皮细胞等外胚层来源的细胞[4-5]。大部分成体干细胞的增殖分化活力会随着年龄增长而衰退[6]，但脐带间充质干细胞不存在上述问题，而仍然能够保持较强的增殖分化能力[7]。同时，脐带间充质干细胞能够分泌抑制细胞凋亡的生长因子，具有免疫豁免和免疫调节的特性，无同种异体免疫排斥反应，且储量丰富，获取方便，体外培养扩增稳定，是临床应用中一种较为理想的干细胞[8]。

本实验以单纯的脂肪移植作为对照，将脐带间充质干细胞和脂肪混合后作为实验组进行研究，结果表明，在移植后第一周，两组移植物均未表现出明显的吸收；1个月，脐带间充质干细胞组的移植物略高于单纯脂肪对照组；2个月的长期观察中，两组移植物均有较大程度的吸收，脐带间充质干细胞组移植物重量仍略高于对照组，然而所有观察时间点两组间差异没有统计学意义。进一步将两组移植物内血管生长因子VEGF和成脂转录因子PPAR-γ的基因表达进行研究，发现脐带间充质干细胞并不能显著提高移植物中VEGF及PPAR-γ的表达，虽然文献[5]提到脐带间充质干细胞能够分泌多种神经营养因子、干细胞因子等，然而，我们的研究结果表明，脐带间充质干细胞对于特定的细胞因子VEGF及转录因子PPAR-γ基因表达没有促进作用，提示脐带间充质干细胞不能像脂肪干细胞一样促进移植物的血管新生和成脂分化。

移植物中脂肪细胞成活的数量和单个细胞的脂肪含量决定着移植物的体积。其内部所含的干细胞成脂分化能力也会对移植物的体积产生影响。有研究证实，脐带间充质干细胞在成脂分化方面的速度要慢于脂肪干细胞，在同等诱导条件下，脐带间充质干细胞需要较长时间才能够出现脂肪细胞的形态改变以及完成向成脂细胞的转变过程[9]。上述实验结果的原因有可能是由于干细胞本身的组织特异性所致：来源于某一组织的干细胞会一定程度的保留原有组织的特性，某些决定其向原组织细胞分化的基因在诱导之前就已经处于预激活状态。脂肪干细胞是脂肪组织内具备增殖和分化能力的干细胞，承担着脂肪组织内成熟脂肪细胞更新的来源，能够高效的分化为成熟脂肪细胞，本就有较高的成脂分化倾向，其基因组中成脂分化转录因子PPAR-γ表达较其他组织来源干细胞处于较高水平。本实验中的脐带间充质干细胞并不能够促进移植物中PPAR-γ基因表达的明显增高，而来源于脂肪组织的脂肪干细胞则能够很好的提高移植物中相关成脂基因PPAR-γ的表达，说明在干细胞辅助脂肪移植中，其组织来源影响了这些细胞在移植后作用的发挥。这可能是导致本实验结果移植物重量没有统计学差异的原因之一。

综上，脐带间充质干细胞不能够有效提高移植物重量、成脂以及血管生成的修复效应，其作为脂肪干细胞的替代，用于游离脂肪移植的效果尚不成熟。