脂氧素抑制内毒素诱导大鼠原代肺成纤维细胞环氧合酶—2及前列腺素E₂的表达

朱天琦 郑声星 叶绿 唐乾

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.005

基金項目：国家自然科学青年基金（81401579）

作者单位：325000 浙江省温州， 温州医科大学附属第一医院麻醉科（朱天琦）;温州医科大学附属第二医院麻醉科（郑声星、叶绿 、唐乾）

通信作者：朱天琦，Email： skytiantian_1234@163.com

【摘要】目的 探讨脂氧素对大鼠原代肺成纤维细胞环氧合酶-2及前列腺素E₂表达的影响。方法 分离、纯化、鉴定得到大鼠肺成纤维细胞，用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）干预建立成纤维细胞体外急性炎症模型，并利用细胞增殖/毒性检测试剂MTT摸索出成纤维细胞急性炎症模型的最适LPS质量浓度和药物干预时间。分别应用不同浓度（0、100、200、400 nmol/mL） 的脂氧素作用于经过LPS诱导的体外培养原代肺成纤维细胞。采用酶联免疫法（ELISA）检测细胞上清液前列腺素E₂（PGE₂）水平， 同时应用Western blot检测原代肺成纤维细胞环氧合酶（COX-2）蛋白的表达。结果 用1 μg/mL LPS干预体外培养的原代肺成纤维细胞6 h能建立较为合理的急性炎症模型。脂氧素能抑制LPS诱导的原代肺成纤维细胞环氧合酶（COX-2）蛋白的表达。对照组、LPS组、LPS组与LPS+脂氧素组测PGE₂质量浓度分别为55.84 pg/mL、411.73 pg/mL、307.07 pg/mL，LPS组与LPS+脂氧素组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论 脂氧素能抑制LPS诱导的原代肺成纤维细胞环氧合酶-2及前列腺素E₂的表达，并呈剂量依赖性。

【关键词】脂氧素;内毒素;肺成纤维细胞;环加氧酶-2;脂多糖类

LipoxinA4 reduces lipopolysaccharide-induced expression of cyclooxygenase-2 and prostaglandin E₂in primary lung fibroblasts of rat Zhu Tianqi， Zheng Shengxing， Ye Lü， Tang Qian.Department of Anesthesia，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China

Corresponding author：Zhu Tianqi，Email： skytiantian_1234@163.com

【Abstract】Objective To explore the effects of lipoxinA4 on expression of cyclooxygenase-2 （COX-2） and prostaglandin E₂（PGE₂） in rat primary lung fibroblast cells （LF） after lipopolysaccharide （LPS） challenge. Methods Primary lung fibroblast cells were incubated with various concentrations （0.1，1，10 μg /mL） of LPS for different lengths of time （3，6，9 h）. Then primary lung fibroblast cells were still incubated in DMEM medium containing LPS in the presence or absence of lipoxinA4. After incubation， the supernatant of medium was collected and the level of PGE₂was detected by using ELISA. The cells were harvested， and COX-2 protein was analyzed by Western blot.Results The model of acute inflammation in fibroblasts was well established by administering 1 μg/mL LPS in fibroblasts for 6 hours. Induction of COX-2 protein by LPS was inhibited by lipoxinA4. The levels of PGE₂in control group， LPS group and LPS+LipoxinA4 group were 55.84 pg/mL， 411.73 pg/mL and 307.07 pg/mL， respectively， and there was a significant difference between LPS group and LPS+LipoxinA4 group （P<0.01）. Conclusion LipoxinA4 down-regulates the expression of the COX-2 induced by LPS in primary lung fibroblast cells and consequently inhibits the production of PGE₂in a dose dependent manner.

【Key words】LipoxinA4;Lipopolysaccharide;Lung fibroblast cells;Cyclooxygenase-2;Lipopoly-saccharides

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是临床常见的危重病，其病死率达35%～58%[1]，内毒素血症引起的ARDS极为常见。传统观念认为急性炎症效应细胞主要有白细胞及巨噬细胞等，目前越来越多证据表明肺成纤维细胞不仅作为肺组织间质环境的主要组成部分[2]，也可以作为急性炎症效应细胞，并能分泌促炎症介质及细胞因子如前列腺素E₂（PGE₂）、白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，同时还能表达环氧合酶-2（cyclooxygenase-2 ， COX-2）[3]。环氧合酶-2 是合成前列腺素（如前列腺素E₂）的关键限速酶，在急性炎症时受多种炎症介质（如细胞因子）刺激而大量表达[4]。在肺部炎症中也存在环加氧酶-2以及前列腺素E₂的高表达[4]。

脂氧素（lipoxin， LX）是一类重要的内源性脂质抗炎介质。脂氧素是花生四烯酸（arachidonicacid，AA）脂加氧酶（lipoxygenase）代谢产物 ， 由5-脂加氧酶与15-脂加氧酶或者由5-脂加氧酶与12-脂加氧酶作用而形成[5]，主要通过跨细胞途径来合成 ，在炎症反应中发挥广泛的抗炎促消退作用[6]。

本研究用不同剂量的脂多糖（lipopoly-saccharide， LPS）刺激体外培养的原代肺成纤维细胞， 建立较为合理的体外成纤维细胞急性炎症模型。另外，笔者还在脂氧素对原代肺成纤维细胞在内毒素直接刺激下COX-2及PGE₂表达的影响方面进行研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

脂氧素A4购于Cayman 公司，新生牛血清（FCS）（美国GIBCO公司），DMEM培养基（美国GIBCO公司），内毒素（LPS，E.coil serotype 055：B5），MTT为 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐购自美国sigma公司， 兔抗人COX-2抗体，鼠抗人vimentin（波形但蛋白） 单克隆抗体和鼠抗人CD31 单克隆抗体均购自abcam公司。辣根酶标记山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG购于北京中杉公司。PGE₂ELISA试剂盒购于R&D公司，Triton X-100和BCA蛋白测定试剂盒购于Pierce公司，以上公司均为公司原产地国家。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肺成纤维细胞分离和培养 参照Tamm等[7]的组织贴壁的方法并进行改良，大鼠称质量，腹腔注射2%戊巴比妥钠80 mg/kg麻醉，仰卧位固定。沿腹中线剪开皮肤，皮下组织，暴露腹腔，切断腹主动脉放血，剪掉横膈膜，暴露胸腔，截取胸骨，小心折断肋骨，摘除胸腺，最大限度地暴露心脏及大血管，从右心室插入套管至肺动脉，用D-Hanks液灌洗至肺明显发白，完整的取出心肺气管，除去心脏和大气道，置于放有预冷的D-Hanks（青霉素100 U/mL、链霉素100 U /mL）的无菌培养皿中，反复用预冷的D-Hanks液冲洗，用小剪刀将肺组织剪碎（<1 mm³） ， 移至10 mL离心管中， 静置5 min后，吸去D-Hanks液后加入0.25%胰蛋白酶（37 ℃预温）5 mL，用吸管反复吹打1.5 min，加入含15%NBS的H-DMEM培养液终止消化，用吸管吹打均匀，1000 r/min离心5 min，弃上清液，再加入少量15%NBS H-DMEM悬浮组织块， 加入培养液以不飘起组织块为宜。每只大鼠肺可接种一个25 mL的培养瓶。37 ℃、 5%CO₂培养箱培养，24 h补加培养液后继续培养，72 h换液。4 d细胞接近融合时，弃去培养液，D-Hanks液轻洗3次，加入0.25%胰酶消化1 min，用含15%NBS的 H-DMEM培养液终止消化，吸管轻轻吹打细胞，收集细胞悬液，1000 r/min离心2 min，弃上清液，用15% NBS的H-DMEM培养液，按1∶2接种传代，40 min后换培养液（差速贴壁法）。

1.2.2 HE染色 将养于培养皿里原代的LF细胞，吸弃上清液，加95%乙醇40 min，加入苏木素15 min染核，自来水洗一遍，0.1%盐酸乙醇分化1 min，再用自来水洗一遍，温水返蓝1 min，最后伊红染5 min，倒置显微镜下观察，如图1A。将经传代的LF细胞消化制成单个细胞悬液， 计数细胞， 调整细胞密度为 1× 10⁴/mL ，接种于24孔板，置于37 ℃5% CO₂培养箱培养24 h，吸弃上清液，加95%乙醇40 min，加入苏木素15 min染核，自来水洗一遍，0.1%盐酸乙醇分化1 min，再用自来水洗一遍，温水返蓝1 min，最后伊红染5 min，倒置显微镜下观察，如图1B。

1.2.3 免疫荧光鉴定 将传代的 LF细胞消化制成单个细胞悬液，计数细胞，调整细胞密度为1×10⁴个/mL，接种于6孔板內（孔内有预先置有多聚赖氨酸涂布的盖玻片），37 ℃ 5%CO₂培养箱常规培养。当细胞铺满盖玻片时，取出盖玻片，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3次，含0.2%Triton的PBS洗两次，再PBS洗两次，5%BSA封闭40 min（室温），保持湿度一抗孵育过夜（4 ℃），次日用PBS洗三次，每次5 min，加二抗（避光）室温孵育1 h，PBS洗7次，每次5 min，Hoechest复染核12 min，PBS洗一次，检测LF vimentin和CD31的表达。

1.2.4 实验分组 实验分三大组： （1）正常对照组：不给予任何处理;（2）LPS处理组：不同时间点（3、6、9 h）给予不同质量浓度LPS（0.1、1.0、10 μg/mL）;（3）脂氧素LPS组：给予不同浓度（0 nmol/mL、100 nmol/mL）脂氧素加上LPS（1 μg/mL）刺激6 h。药物刺激前均无血清DMEM培养基培养24 h。

1.2.5 经典细胞增殖/毒性检测试验（MTT） MTT[8]法实验步骤：将分离纯化的LF用含15%NBS得培养液配成单个细胞悬液，接种入6孔板，2 mL/孔，37 ℃5%CO₂培养箱培养，待细胞80%～90%呈融合状态时，换无血清培养基培养24 h后重悬，调整密度为1×10⁶个/mL，加入96孔板，100 μL/孔，5复孔，同时设空白对照孔（不加细胞），加入不同质量浓度LPS作为刺激物，建立体外炎症模型，同时以PBS作为阴性对照。药物干预时间设三个，分别为3、6、9 h，至规定时间后加入MTT试剂，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配制，pH=7.4）20 μL。继续于37 ℃，CO₂培养箱培养孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150 μL DMSO，震荡10 min，使结晶物充分融解。放入酶标仪检测，测定波长490 nm各孔的吸光度值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.6 酶联免疫法（ELISA）方法检测细胞上清液中PGE₂的含量 LPS或（及）脂氧素作用结束后收集细胞上清液，2000 r/min离心5 min后待测。酶标板各孔加入细胞上清液50 μL， 37 ℃包被2 h。弃包被液，应用洗涤液洗涤5 min×5次，加入HRP标记的鼠抗人IgG，37 ℃、1 h，洗涤液洗涤5 min×5次，加入TMB显色液室温下避光10 min，加入终止液终止反应，酶标仪检测450 nm吸光度（A）值，应用洗涤液替代样品为阴性对照组。各孔检测的吸光度值减去阴性对照组的吸光度值为各孔实际吸光度值，间接反映上清液中PGE₂的含量。

1.2.7 Western-blot检测COX-2蛋白的表达 取1 μg/mL LPS合并不同浓度脂氧素诱导培养6 h后的肺成纤维细胞，加入适量细胞裂解液，冰上孵育40 min，12 000 r/min离心20 min，上清液即为总蛋白。将总蛋白进行SDS PAGE凝胶电泳，然后电转移至NC膜上。把膜放入含5 g脱脂奶粉的TBST（10 mmol/L Tris pH 7.5，100 mmol/L NaCl，0.1% Tween20）中室温封闭1 h，加入兔抗人COX-2和小鼠抗人β-actin多克隆抗体（COX-2以1∶500稀释，β-actin以1∶1000稀释）4 ℃摇动过夜。次日用TBST于室温下洗膜3次，每次15 min，接着加入辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体（1∶2000稀释）及山羊抗小鼠IgG抗体（1∶2000稀释），在室温下轻轻摇动1 h，然后用TBST室温下洗膜3次，每次15 min。最后用化学发光法曝光显迹，按化学发光显影试剂盒（ECL）说明要求加ECL试剂，室温下温育2 min后对X线片曝光。

1.3 统计学方法

计量资料以均数±标准差（x±s）表示，以SPSS 16.0统计软件进行分析处理，多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因数方差分析。方差齐性者两两比较采用LSD法，方差不齐者进行Dunnets T3检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺成纤维细胞纯化及鉴定

24 h后显微镜下可见长梭型细胞从组织块中爬出，72 h后细胞生长迅速，4 d接近融合。在原代培养过程中，LF还混有少量的圆形Ⅱ型肺泡上皮（AECⅡ）（图1 A1）， 因为传代后差异贴壁利用成纤维细胞贴壁的时间早于ATⅡ细胞，从而去除ATⅡ细胞。LF呈星状或梭形，核椭圆形，核仁明显，细胞伸出多个突起，并连接成网状（图 1A2）。传代后的LF几乎长满整个培养瓶，偶见其他非纤维细胞，细胞增殖能力强，3 d接近融合，连续传4～5代以后，细胞增殖能力方逐渐下降。免疫荧光检测肺成纤维细胞呈vimentin阳性，CD31阴性（图1B）。

2.2 MTT检测结果

由表1可以看出，在LPS的刺激下，大鼠肺成纤维细胞出现了增殖反应，三个浓度梯度组与对照组相比，均出现了增殖反应（P<0.01）。其中刺激质量浓度为1 μg/mL 时，与其他三个实验组相比，细胞增殖反应最大（P<0.01），且在各个浓度的不同刺激时间里，6 h时，细胞增殖反应较大（P<0.05），因此可以确定LPS刺激致ARDS模型的最适刺激质量浓度为1 μg/mL，最佳刺激时间为6 h。

2.3 脂氧素對于LPS刺激肺成纤维细胞COX₂蛋白表达的影响

正常肺成纤维细胞中COX-2蛋白有微量表达，脂氧素抑制LPS刺激肺成纤维细胞的COX-2蛋白表达，LPS组与LPS+脂氧素组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。COX-2 蛋白表达结果以COX-2/β-actin吸光度的相对值计算（图2）。

2.4 脂氧素对于LPS刺激肺成纤维细胞上清液PGE₂含量的影响

脂氧素能抑制肺成纤维细胞环加氧酶-2（COX-2）表达，因此推测脂氧素是否也能抑制其产物前列腺素E₂的表达，肺成纤维细胞上清液ELISA检测发现，脂氧素能抑制LPS刺激后肺成纤维细胞上清液中PGE₂的含量。对照组，LPS组，LPS组与LPS+脂氧素组测PGE₂质量浓度分别为55.84 pg/mL、411.73 pg/mL、307.07 pg/mL。LPS组与LPS+脂氧素组间比较差异有统计学意义（P<0.01）（图3）。

3 讨论

急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征是临床常见急危重症，病死率极高[9]。目前对于针对内毒素性肺损伤的治疗，不难发现抑制炎症启动阶段的促炎介质释放是主旋律[10]。越来越多的研究资料表明炎症是一个从启动到消退的程序化过程，炎症反应的及时消退是防止炎症走向慢性的关键环节，因此，这种内源性炎症消退机制并在此基础上提出的“促炎症消退”的炎症治疗新策略已成为新的研究热点[10]。

成纤维细胞是人体数量最多的一种间质细胞[2]。成纤维细胞主要功能包括细胞外基质的合成与重造、调节上皮细胞的分化、调节炎症过程以及参与组织损伤的修复[11]。目前越来越多的证据表明成纤维细胞在炎症的发生中起到重要的作用，而且能促进炎症成功消退。通过调控成纤维细胞可以调控炎症的发生及消退过程。

在呼吸系统炎症中前列腺素类物质如前列腺素E₂（PGE₂）作为主要的炎症介质，起到关键作用[12]。前列腺素类物质属于类花生酸家族，是花生四烯酸经过环加氧酶催化而产生[11]。环氧合酶（COX）是花生四烯酸转化成类花生酸类物质途径中重要的限速酶[13]。机体中主要有两种环加氧酶异构体：环加氧酶-1（COX-1）及环加氧酶-2（COX-2）[13]。COX-1属于管家酶，在大多数组织和细胞中均有表达，其表达基本上是相对恒定的[14]。COX- 2在多数情况下处于静息状态或低表达，只有在炎症反应或其他病理条件下才大量表达[15]。

有研究报道预先给予脂氧素类似物能减轻内毒素所致的小鼠急性肺损伤程度[16]。据报道脂氧素抑制肺纤维化并促进其炎症消退[17]。另外据Medeiros等[18]报道脂氧素A4同样能抑制内毒素所致大鼠眼葡萄膜炎的环氧合酶表达及其活性。本研究结果也发现肺成纤维细胞在LPS刺激下COX-2表达增加。据文献报道COX-2基因敲除的小鼠炎症反应性增加[19]。另外，环加氧酶是催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质 （PGS） 的限速酶[13]，因此环加氧酶-2表达增加在呼吸系统炎症发展过程中起到关键的作用。

脂氧素是花生四烯酸脂加氧酶代谢产物，主要在炎症等病理过程中通过跨细胞途径来合成[5-6]，在炎症反应中发挥广泛的抗炎促消退作用。在对肺部疾病（如哮喘）体外及体内研究都表明脂氧素具有抗炎促炎症消退作用[20]。据报道脂氧素能抑制肺成纤维细胞的增殖，并抑制肺纤维化[20-21]。笔者利用内毒素（LPS）刺激体外培养的肺成纤维细胞，利用细胞增殖测定，发现1 μg/mL LPS刺激6 h可以建立较为合理的体外炎症模型。另外脂氧素能抑制LPS刺激下其COX-2蛋白的表达，也同时能抑制LPS刺激下其上清液PGE₂水平。因此，笔者认为脂氧素可能部分通过依赖COX-2的方式促进肺部炎症消退，从而为急性肺损伤的治疗提供了一个新的治疗靶点。

参考文献

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