江川县鸡大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

李 琳，寸诚芬，李正甫，周庆国，白祖留

(1.江川县畜牧兽医局，云南 江川 652600;2.腾冲县动物疫病预防控制中心，云南 腾冲 679100;3.保山市畜牧工作站，云南 保山 678000;4.通海县四街镇农业综合服务中心，云南 通海 652702;5.昆明锦农堂农牧科技有限公司，云南 昆明 650000)

鸡大肠杆菌病是指部分或全部由致病性大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)所引起的局部或全身性感染的疾病[1]，临床上表现为败血症、心包炎、气囊炎、肝周炎和腹膜炎。鸡大肠杆菌除单独引起鸡只死亡外，还常与其它细菌[2]、病毒[3]和寄生虫[4]混合感染或继发感染，使发病率、死亡率明显升高，给养鸡业造成严重的经济损失。鸡大肠杆菌还可引发人类食源性疾病，给人类公共卫生安全带来威胁，在公共卫生中也日益受到人们重视。近年来，随着各种抗生素的滥用，大肠杆菌的耐药性不断增强，多重耐药菌株的不断增多，给鸡大肠杆菌病的治疗造成困难。为了解江川县鸡大肠杆菌的耐药性，对2013—2014年江川县6个养鸡场疑似鸡大肠杆菌病的肝脏、心包液等病料进行病原菌的分离鉴定、形态学观察、小白鼠致病性试验和耐药性分析，用于指导鸡大肠杆菌病的临床用药。

1 病料来源

病料来源于2013年3月至2014年11月，江川县不同乡(镇)的6个养鸡场疑似鸡大肠杆菌病病鸡的肝脏、心包液等病料。每只鸡所取病料为1份病料，共17份病料。不同时间采集的病料均保存于－20℃，用于细菌分离培养。

2 细菌分离

将17份样品的肝脏和心包液，分别划线接种于普通营养琼脂培养基，放置于普通培养箱中37℃培养过夜观察结果，可见每份病料样品接种的营养琼脂培养基上均长出直径1～2mm的中等大小乳白色菌落，菌落凸起、光滑、湿润、边缘整齐。从每份病料样品接种的营养琼脂培养基上挑取1个单菌落，用营养琼脂培养基进行纯培养，培养过夜后先用接种环分别挑取菌落涂布载玻片制作细菌涂片，用于后续的染色鉴定。再用营养肉汤培养基分别将各个纯培养物洗脱下来，分别编号为菌1—菌17，4℃保存，用于后续的鉴定、致病性试验和耐药性分析。

将菌1—菌17分别接种麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝培养基，置普通培养箱中37℃培养过夜观察结果，可见17株分离株在麦康凯琼脂培养基上均呈中等大小紫红色菌落，菌落凸起、光滑、湿润、边缘整齐;在伊红美蓝培养基上均呈中等大小带绿色金属光泽的紫黑色菌落。综合菌1—菌17在营养琼脂、麦康凯琼脂和伊红美蓝培养基上的生长特性，将17株分离株初步鉴定为大肠杆菌。

3 细菌染色镜检

将上述制备的菌1—菌17的细菌涂片，按照细菌革兰氏染色标准步骤进行染色，再将染色好的细菌涂片用显微镜油镜镜检，镜检结果均为革兰氏阴性中等大小杆菌。细菌形态结合上述培养特性，将17株分离株鉴定为大肠杆菌，并分别命名为大肠杆菌E.coli－1—E.coli－17。

4 致病性试验

将大肠杆菌E.coli－1—E.coli－17分离株分别接种营养琼脂培养基，37℃培养过夜，用灭菌生理盐水将菌苔分别洗脱下来，制成菌悬液，用平板计数法测定其浓度分别为1.7×108～3.2×108CFU/mL，每株大肠杆菌各腹腔注射3只小白鼠，每只小白鼠注射0.2 mL，再取3只小白鼠各腹腔注射0.2mL灭菌生理盐水作为对照。结果除了E.coli－5和E.coli－12接种的小白鼠在接种后72 h仅有部分死亡，表明其对小白鼠的致病性较弱。其它15株大肠杆菌接种的小白鼠均在72 h内全部死亡，表明其对小白鼠有强致病性。

5 药敏试验

用青霉素 G(P)、氨苄西林(AM)、阿莫西林(AMX)、头孢噻吩钠(CF)、头孢氨苄(CX)、头孢呋辛钠(CXM)、头孢他啶(CAZ)、卡那霉素(K)、链霉素(S)、庆大霉素(GM)、氧氟沙星(OFL)、诺氟沙星(NOR)、痢特灵(FR)、磺胺甲恶唑(SMX)和氟苯尼考(FFC)共15种常用抗生素(均购自北京天坛药物生物技术开发有限公司)对分离株进行耐药性检测，方法按照美国临床试验标准研究所CLSI/NCCLS 1999—2005年颁布的药敏实验标准和规定进行。参照CLSI/NCCLS 1999—2005的标准将各菌株的耐药性判定为耐药(R)、敏感(S)或中介(I)，17株致病性大肠杆菌的耐药性见表1。由表1可知17株致病性大肠杆菌耐药性如下:12耐1株，11耐2株、9耐3株，8耐4株、7耐3株、6耐2株、5耐2株。痢特灵、头孢呋辛钠、头孢他啶、氟苯尼考的耐药率低于17.6%(3/17)，即分离株对该4种药物的敏感性高于83.4%，可作为江川县鸡大肠杆菌病治疗的首选药物。

表1 17株鸡致病性大肠杆菌耐药性

6 讨论

大肠杆菌病是危害养鸡业的重要细菌性传染病，随着抗生素的滥用，大肠杆菌耐药性日益增强，多重耐药菌株不断出现，给鸡大肠杆菌病的治疗造成困难。毕保良等[5]2012年报道了猪大肠杆菌对15种常用抗生素的耐药性，结果显示在7株猪大肠杆菌中14耐1株，13耐2株，11耐2株，8和8耐以下2株，表明云南猪大肠杆菌已经呈现出十分严重的多重耐药性。杨斌等[6]2010年也报道了云南省鸡大肠杆菌的耐药性，结果显示其对青霉素、红霉素和环丙沙星等多种药物耐药，对氟苯尼考、头孢曲松等药物敏感。本研究报道了江川县2013—2014年鸡大肠杆菌的分离鉴定及其耐药性，结果发现从疑似鸡大肠杆菌病病例中分离到的17株鸡大肠杆菌均为强致病性菌株;药敏试验表明江川县鸡大肠杆菌也出现了多重耐药趋势，分离株对15种常用抗生素显示出严重的多重耐药性，其中12耐1株、11耐2株、9耐3株，8耐4株，8耐以下共7株，均在5耐以上。青霉素、氨苄西林、头孢噻吩、头孢氨苄、卡那霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、链霉素和磺胺甲恶唑的耐药率均在58.8%(10/17)以上。痢特灵、头孢呋辛钠、头孢他啶、氟苯尼考的耐药率低于17.6%(3/17)。在实际应用中，用痢特灵、头孢呋辛钠、头孢他啶和氟苯尼考这4中药物对江川县6个养鸡场鸡大肠杆菌病例进行治疗，取得非常好的治疗效果，这4种敏感药物可作为江川县鸡大肠杆菌病治疗的首选药物，值得推广应用。

大肠杆菌的耐药性复杂，不同地区鸡场大肠杆菌耐药性差别很大，敏感药物有所不同;同一鸡场不同时期分离的菌株的耐药性也有较大差异，敏感药物也不相同。因此，为了科学用药治疗鸡大肠杆菌病，减缓耐药性的发展，避免超级细菌的产生，同时也为了养鸡业的持续健康发展和人类公共卫生安全，在临床用药治疗前必须进行细菌分离鉴定和药敏试验，筛选敏感药物进行治疗。同时，加强鸡的饲养管理，控制饲养密度，防止温度骤变，加强卫生消毒，提供优质饲料和清洁饮水，严格执行卫生防疫措施，减少各种诱发因素也是防治鸡大肠杆菌病的重要措施。

[1]Y.M.saif.禽病学(第十一版)[M].苏敬良，高福，索勋主译，北京:中国农业出版社，2005:712－738.

[2]张玉政，崔卫涛.鸡传染性鼻炎和大肠杆菌混合感染的诊治[J].山东畜牧兽医，2011(6):89－90.

[3]谭红，张汝，常志顺，等.蛋鸡大肠杆菌和H9亚型禽流感病毒混合感染的诊治[J].云南畜牧兽医，2014(4):8－9.

[4]高佩民.三黄鸡大肠杆菌和球虫混合感染的诊治[J].养禽与禽病防治，2012(5):41－42.

[5]毕保良，李富祥，胡骑，等.云南多重耐药猪源大肠杆菌的分离鉴定及其耐药机制初步研究[J].上海畜牧兽医通讯，2012(5):6－7.

[6]杨斌，王传禹，杨向东，等.云南省鸡致病性大肠杆菌的血清型鉴定及药敏试验[J].云南畜牧兽医，2010(3):2－4.