大孔树脂纯化皱皮柑果皮黄酮工艺研究

张 珉， 孙化鹏， 李良导， 彭 淼， 钟晓红*

(1.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004； 2.湖南农业大学，湖南 长沙 410128； 3.湖南女子学院，湖南 长沙 410004)

大孔树脂纯化皱皮柑果皮黄酮工艺研究

张 珉1， 孙化鹏2， 李良导3， 彭 淼2， 钟晓红2*

(1.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004； 2.湖南农业大学，湖南 长沙 410128； 3.湖南女子学院，湖南 长沙 410004)

以皱皮柑果皮为材料，筛选出对皱皮柑果皮黄酮吸附和解吸性能好的大孔树脂，并探讨大孔树脂纯化皱皮柑果皮黄酮的工艺条件。结果表明：弱极性的AB-8大孔树脂对皱皮柑果皮黄酮的吸附和解吸效果较好。AB-8大孔树脂纯化皱皮柑果皮黄酮的最佳工艺条件为： 以50%乙醇作为洗脱剂，洗脱剂流速1.5 BV/h，洗脱剂用量为3倍柱床体积。纯化后皱皮柑果皮黄酮纯度可达到15.45%。

皱皮柑； 黄酮； 大孔树脂； 纯化

皱皮柑 (CitrusspeciosaHort.ex Tseng cv.Zhoupigan)属柑橘(Citrus)地方品种，果实扁圆形，果面粗糙，皮厚，囊壁稍带苦味，是一种药食同功的保健水果[1-2]。柑橘鲜食或加工，果皮是其主要副产物，而黄酮是柑橘果皮主要功能性成分之一，具有降血压、降低胆固醇、抗氧化、调节免疫等多种功能[3-10]。因此，从皱皮柑果皮中提取纯化黄酮，对于皱皮柑的深加工及其在医药、食品工业等领域的应用，具有重要的理论与实际意义[11]。我们采用乙醇-超声波法提取皱皮柑果皮总黄酮，并研究大孔树脂纯化皱皮柑果皮总黄酮的工艺条件，旨在为高浓度橘皮黄酮的规模化生产提供理论依据。

1 试验材料

1.1 材料

皱皮柑，产自湖南华容；D101、AB — 8、X — 5、NKA — 9大孔吸附树脂；盐酸、氢氧化纳、乙醇均为分析纯。

1.2 仪器

玻璃层析柱(φ16mm×400mm)；B — 49旋转蒸发器(瑞士Buchi)；KQ3200E超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；ALPHA真空冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂)；UV — 2550紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)。

2 研究方法

2.1 供试液的制备

皱皮柑果皮烘干，粉碎，粉末用50倍量50%乙醇超声提取2次，每次20min，抽滤得皱皮柑果皮黄酮粗提液。

2.2 标准曲线的建立

准确吸取0.1mg/mL芦丁标照品溶液0、1、2、3、4、5mL分别置于10mL容量瓶中，各加30%乙醇至5mL；加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加4%氢氧化钠溶液4mL，再加蒸馏水至10mL，摇匀，放置15min。以第一管作空白，在吸收波长510nm处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，标照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线[12]，得标准曲线方程为：y=11.009x+0.0053，R=0.9998。

2.3 树脂预处理

大孔树脂预处理参照文献[12]的方法进行。

2.4 树脂的筛选

2.4.1 树脂吸附率、解吸率的测定 称取预处理过的4种树脂D101、AB—8、X—5、NKA—9各0.5g，加入等浓度(C0)的供试液50mL，在电动震荡机上以频率120次/min震荡24h后，测定吸附液中的黄酮浓度(Ce)。去除吸附液后，将树脂加入90%乙醇50mL，在电动震荡机上以频率120次/min震荡24h后，测定解吸液中黄酮浓度(C1)。按照下式分别计算静态吸附量、吸附率、解吸量和解吸率[12-13]。

(1)

(2)

(3)

(4)

式中：V—吸附液的容积，mL；W—树脂质量，g；C0—吸附前样液中黄酮的浓度，mg/mL；Ce—吸附后上清液中黄酮的浓度，mg/mL；V1—解吸液的容积，mL；C1—解吸液中黄酮的浓度，mg/mL。

2.4.2 树脂静态吸附动力学曲线 称取预处理过的4种树脂D101、AB — 8、X — 5、NKA — 9各0.5g，加入等浓度的供试液50mL，以树脂与供试液接触时为0时刻，每隔30min各取样1mL，测定黄酮含量，绘制树脂的静态吸附动力学曲线。

2.5 树脂AB — 8 动态吸附工艺参数的确定

2.5.1 洗脱剂浓度的选择 将等浓度黄酮粗提液10mL上柱，静态吸附30min。先用3倍柱床容积的蒸馏水淋洗，再分别用体积分数为30%、50%、70%、90%乙醇进行洗脱，洗脱流速控制为1.5BV/h(以每小时相对于1.5倍柱床容积的流速通过树脂层)，收集各洗脱液，测定吸光度。

2.5.2 洗脱剂流速的确定 将等浓度黄酮粗提液10mL上柱，静态吸附30min。先用3倍柱床容积的蒸馏水淋洗，然后用50%乙醇溶液分别以1BV/h、1.5BV/h、2BV/h流速进行洗脱，收集各洗脱液，测定吸光度。

2.5.3 洗脱剂用量的确定 将等浓度黄酮粗提液10mL上柱，静态吸附30min。先用3倍柱床容积的蒸馏水淋洗，然后分别用1、2、3、4倍柱床容积的50%乙醇进行洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，收集各洗脱液，测定吸光度。

2.6 皱皮柑果皮黄酮纯度测定

取皱皮柑果皮黄酮溶液，按2.2方法测其吸光度，带入回归方程计算相应的黄酮浓度，再乘以溶液的容积得总黄酮质量，记为p，然后将该溶液浓缩真空干燥，得产品干燥后的质量，记为q，按下式计算黄酮纯度：

(5)

3 结果与分析

3.1 大孔树脂型号的选择

3.1.1 树脂吸附率、解吸率的测定 由表1可知，AB — 8大孔树脂对皱皮柑果皮总黄酮的吸附率最大，达到48.97%，其次为X — 5 和D101树脂。4种大孔树脂对皱皮柑果皮总黄酮的解吸率大小顺序为：X — 5>AB — 8>D101>NKA — 9。皱皮柑果皮总黄酮具有多酚结构和糖苷键，在水溶液中极性较弱，因此有利于弱极性的AB — 8型和非极性的X — 5型大孔树脂的吸附与解吸。

表1 4种大孔树脂对皱皮柑果皮总黄酮的吸附和解吸情况Tab.1 Theabsorptionanddesorptionpropertiesoffourres-ins树脂型号吸附量(mg/g)吸附率(%)解吸量(mg/g)解吸率(%)D10112.8644.3410.6082.43AB—814.2048.9713.6896.34X—513.8647.7913.6098.12NKA—95.8620.214.5076.79

3.1.2 树脂的静态吸附动力学曲线 由图1可知，大孔树脂对皱皮柑果皮黄酮的吸附速度在起始阶段比较快，随时间延长，逐渐趋于平缓。考虑到纯化效率等因素，黄酮样品液上柱后静态吸附30min即可进行洗脱。4种树脂中，AB — 8型树脂对皱皮柑果皮黄酮的吸附速度最快，其次是X — 5型树脂。考虑到AB — 8型树脂对黄酮也具有较高的吸附率和解吸率，故选择其作为柱材料。

图1 4种大孔树脂的静态吸附动力学曲线Fig.1 Kinetics curves of static adsorption of four resins

3.2 AB — 8大孔树脂纯化皱皮柑果皮黄酮的工艺研究

3.2.1 洗脱剂浓度的选择 由图2可知，乙醇浓度对AB — 8树脂解吸附皱皮柑果皮黄酮有较大影响。在一定范围内，随着乙醇浓度的上升，黄酮的解吸率增大。但当乙醇浓度达到50%时，继续增加乙醇浓度对提高解吸率效果不明显。同时，考虑到成本因素，选择50%乙醇作为洗脱剂。

图2 乙醇浓度对解吸率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentrations on desorption rate

3.2.2 洗脱剂流速的确定 由图3可知，在一定的洗脱剂用量下，皱皮柑果皮黄酮的解吸率随着洗脱剂流速的增大而逐渐减小。当洗脱剂流速为1BV/h时，黄酮解吸率最高；当洗脱剂流速为1.5BV/h时，黄酮解吸率与流速1BV/h时的解吸率相差不大。考虑到纯化效率，选择洗脱剂流速为1.5BV/h。

图3 洗脱剂流速对解吸率的影响Fig. 3 Effect of elution flow rate on desorption rate

3.2.3 洗脱剂用量的确定 由图4可知，随着洗脱剂用量的增加，皱皮柑果皮黄酮的解吸率逐渐增大。当洗脱剂用量为3倍柱床容积时，皱皮柑果皮黄酮已基本被洗脱下来，再增加洗脱剂用量，黄酮解吸率变化不大。考虑到成本及效率因素，选择洗脱剂用量为3倍柱床容积。

3.3 皱皮柑果皮黄酮纯度检测

经计算，皱皮柑果皮黄酮粗提液中黄酮纯度为6.40%，经AB — 8大孔树脂纯化后黄酮纯度达到15.45%，是原纯度的2.41倍。

图4 洗脱剂用量对解吸率的影响Fig. 4 Effect of ethanol volume on desorption rate

4 结论与讨论

(1) 大孔吸附树脂依据其聚合的单体组成不同，可以分成非极性和极性两大类[14-15]。本研究表明，非极性和弱极性大孔树脂对皱皮柑果皮黄酮吸附效果较好。4种大孔树脂中，弱极性的AB — 8大孔树脂对皱皮柑果皮黄酮的吸附速度最快，吸附率高，易解吸，适宜分离纯化皱皮柑果皮总黄酮。

(2) AB — 8大孔树脂纯化皱皮柑果皮黄酮的最佳工艺参数为：以50%乙醇作为洗脱剂，洗脱剂流速为1.5BV/h，洗脱剂用量为3倍柱床容积。在此优化工艺条件下，皱皮柑果皮黄酮纯度由原来的6.40%提高到15.45%，说明AB — 8大孔树脂对皱皮柑果皮黄酮的纯化具有较好的效果。

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Purificationofflavonoidfromrough-peelmandarinpeelwithmacroporousresin

ZHANG Min1, SUN Huapeng2, LI Liangdao3, PENG Miao2, ZHONG Xiaohong2*

(1.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, China;2.Hunan Agriculture University,Changsha 410128, China;3.Hunan Women’s University, Changsha 410004, China)

Used the peel of rough-peel mandarin as the raw materials, the suitable macroporous resin type with good adsorption and desorption capacity for flavonoid from rough-peel mandarin peel was screened, and the purification conditions was studied. The results showed that, AB-8 macroporous resin with weak polar had higher flavonoid adsorption capacity. The optimal purification conditions were as follows: 50% ethanol as eluent, elution flow rate of 1.5BV/h, and the eluent volume of 3 times bed volume. The purity of flavonoid from rough-peel mandarin peel after purification could reach 15.45%.

CitrusspeciosaHort.ex Tseng cv.Zhoupigan; flavonoid; macroporous resin; purification

2015-03-30

湖南省林业科学院青年科研创新基金项目(2013LQJ10)。

* 为通讯作者。

R 284.2

A

1003 — 5710(2015)03 — 0050 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2015. 03. 012

(文字编校：张 珉)