高压氧对孤独症大鼠行为及外周血IL-1β、IL-6和IL-10水平的影响*

刘仕成，贾飞勇，徐乃军，夏天亮，张丽萍，姜慧轶#

1)吉林大学第一医院儿科 长春130021 2)吉林大学第一医院小儿康复科 长春130021 3)吉林大学第一医院二部儿科 长春130031 4)吉林大学第一医院二部急诊科 长春130031 5)吉林大学第一医院神经内科 长春130021

孤独症谱系障碍(简称孤独症)是影响儿童成长发育的重要疾病之一，目前已经引起全世界各个国家的重视。2012年美国疾病预防控制中心数据［1］显示，孤独症自首次报道以来其发病率呈现日益增长的趋势，患病率约为1．4%。然而孤独症目前尚无特效疗法。有研究［2］发现，采用高压氧治疗孤独症能够改善患儿烦躁、多动、刻板等行为，提高患儿的语言能力，但是其作用机制尚不清楚。高压氧作为一种无创性的治疗手段，目前已被应用于多个领域，它不但有助于增加机体血氧含量、降低血黏度、改善脑循环、减轻脑水肿及脑细胞的损害，还能够在某种程度上抑制细胞因子的释放。有研究［3-4］报道，胎儿期细胞因子水平的失调可能是孤独症发生的原因之一。该研究拟建立孤独症大鼠模型，比较孤独症模型鼠和正常对照鼠的行为及外周血中细胞因子IL-1β、IL-6 和IL-10 水平的差异，并探讨高压氧治疗孤独症的可能机制，为高压氧治疗孤独症提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 实验动物、主要试剂和仪器 健康成年Wistar雄性大鼠50只，体重(300 ±50)g，雌性大鼠50只，体重(250 ±50)g，购自吉林大学实验动物部，动物合格证号:SCK(吉2008-0005)。所有实验动物的喂养及实验程序均严格遵照吉林大学实验动物保护条款。丙戊酸钠(VPA)为美国Sigma 公司产品，IL-1β、IL-6 和IL-10 测定试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。旷场实验及EthoVision 影像跟踪系统由荷兰Noldus 公司提供，有机玻璃箱为长春有机玻璃厂制作，程控避暗箱为中国医学科学院药物研究所提供，刻板行为检查装置为自制，动物实验用高压氧舱由吉林大学第一医院高压氧科提供。

1．2 VPA 孤独症大鼠模型的制备与实验分组 参照Schneider 等［5］的方法建立和评价孤独症动物模型。将育龄雌性与雄性Wistar 大鼠合笼交配繁殖，次日晨检查到阴栓的雌鼠记为受孕第1天。第12．5天，一部分孕鼠腹腔注射600 mg/kg 的VPA，余孕鼠注射等体积生理盐水。子鼠出生后母乳喂养至生后21 d 断乳，区分性别，选用雄性子鼠用于实验。在20只给予VPA 雌鼠所产子鼠中选择10只进行高压氧治疗(高压氧组):大鼠在高压氧仓中分别吸纯氧60 min，压力为300 kPa，1次/d，连续治疗15 d，余10只为模型组。另取腹腔注射等量生理盐水的孕鼠所产的子代雄鼠10只为正常对照。

1．3 生长发育和行为学评价 对所有实验子鼠观察以下指标。

生长发育监测:于生后第7、12、21、35、70天称量子鼠体重。

运动活性监测:①于出生后第67天用旷场实验［6］的方法检测大鼠的自发运动，记录每只鼠的水平运动次数、垂直运动次数、中央格穿过率及中央格时间百分比、粪便粒数。②于生后第69天，根据文献［7］的标准，检测重复刻板行为。

社会行为监测:①出生第35天大鼠社会行为的检测。实验前所有大鼠经3．5 h 隔离。实验开始时，将同一组内的2只大鼠放入测试笼内15 min 进行成对测试。记录大鼠钳住另一只大鼠的潜伏期和钳住次数。②出生第75天大鼠社会行为的检测。于实验前1 周将被检测鼠单笼隔离饲养。实验当日，每只被检测鼠和一只刺激鼠共同置于检测笼内10 min，测定社会行为出现的潜伏期和次数(成年鼠的社会行为包括舔或嗅刺激鼠的身体，追逐刺激鼠或趴或爬到刺激鼠身上)。

学习记忆测试:于大鼠出生第80天，将检测鼠背对着程控避暗箱洞口放入明箱之中，并启动秒表，记录大鼠从明箱进入暗箱的潜伏期，训练5 min，记录这期间进入暗箱的次数，24 h 后重复上述操作，记录进入暗箱的时间及被电次数，此次结果记入实验结果中。

1．4 血浆IL-1β、IL-6 和IL-10 水平的测定 行为学评分结束后，各组取5只大鼠用镊子摘下眼球，采集静脉血约5 mL，4℃、2 000 r/min 离心20 min，留取血浆，采用ELISA 法测定血浆IL-1β、IL-6 和IL-10水平，具体实验步骤按试剂盒说明书操作。

1．5 统计学处理 使用SPSS 19．0 处理数据。采用重复测量数据的方差分析比较3组大鼠出生不同时间体重、社会行为出现次数及潜伏期的差异;采用单因素方差分析比较3组大鼠部分自发运动指标的差异，两两比较采用SNK-q 检验;采用秩和检验比较3组大鼠粪便粒数、刻板行为评分及大鼠血浆IL-1β、IL-6 和IL-10 水平的差异。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 3组大鼠生长发育及行为学评价结果

2．1．1 生长发育监测结果 见表1。与正常对照组比较，模型组大鼠发育迟缓，表现为体重偏低，经高压氧治疗后，小鼠体重升高。

表1 出生不同时间3组大鼠体重比较 g

2．1．2 运动活性监测结果 见表2～5。模型组大鼠较正常对照组表现出重复刻板行为及社会接触的减少，而经高压氧治疗后上述行为有所改善。

表2 3组大鼠自发运动监测指标比较

表3 出生第35天和第75天3组大鼠社会行为出现次数及潜伏期比较

表4 3组大鼠刻板行为比较

表5 3组大鼠被电次数和避暗潜伏期比较

2．2 3组大鼠血浆细胞因子水平 模型组血浆IL-1β、IL-6 和IL-10 水平最高，高压氧组次之，正常对照组最低。见表6。

表6 3组大鼠血浆IL-1β、IL-6 和IL-10 水平比较ng/L

3 讨论

大鼠的胚胎11 d 左右神经管开始闭合，12 d 左右脑运动神经元和核团开始形成［8］。如果胚胎在此期间受到外界不利因素的影响，如VPA 等就会影响神经系统的正常发育而导致神经系统疾病的发生。VPA 孤独症动物模型是孤独症的经典模型。在受孕12．5 d 的母鼠腹腔注射VPA，其后代子鼠的异常行为表现与孤独症患儿相似，比如:社交及探索行为减少、重复刻板行为、焦虑紧张状态等［5-7］。该实验中作者建立了VPA 孤独症大鼠模型，并进行生长和发育、行为学等相关监测，结果显示孤独症模型大鼠生长发育迟缓、重复刻板行为、社会行为减少，接近人类孤独症的行为表现，表明造模成功。

环境因素在孤独症的成因中具有重要作用，多种多样的环境因素可能通过宿主炎症反应作用于胚胎神经发育决定性的窗口期。细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有生物学效应的小分子物质。细胞因子及其受体在正常神经的分化和可塑性以及行为编程中具有重要作用，但异常的细胞因子水平则可引起机体认知受损、学习能力差、异常焦虑、刻板行为、社会交往减少等孤独症样行为。在发育过程中，细胞因子和趋化因子在大脑中处于极低的水平，升高的细胞因子被证实可对脑组织的正常发育产生不利影响［9-11］，如:IL-6 水平升高被证实可增加兴奋性突触，减少抑制性突触，增加树突的长度和促进蘑菇状树突的形成，并可减少海马处兴奋后抑制，进而影响神经环路的平衡和突触的可塑性;IL-1β 在少突胶质细胞的毒性、神经轴突生长和在海马稳态突触可塑性的调节上具有重要作用;IL-10 可抑制促炎因子的合成并抑制炎性细胞的活化、聚集，使活化T 细胞凋亡，抑制淋巴细胞和巨噬细胞功能，对抗脑组织内的过度炎症性反应，减轻炎症反应对脑组织的损伤，保护脑组织。该研究结果显示模型组大鼠血浆中上述3 因子的水平升高，与上述研究结果相符。于方等［8］对缺血缺氧性脑病患儿的研究发现高压氧治疗组患儿血浆及脑脊液中IL-6、TNF-α 与常规治疗组相比明显降低。王国忠等［12］对减压病小鼠行高压氧治疗后发现脑组织IL-1β 含量降低，而IL-10 含量无明显改变。包长顺等［13］研究证实高压氧治疗后不仅降低了促炎性细胞因子，也降低了抗炎性细胞因子如IL-10。该研究结果显示，高压氧治疗后，孤独症模型鼠生长发育迟缓、重复刻板行为及社会活动减少均有改善，同时血浆IL-1β、IL-6 和IL-10 水平降低，基本与上述研究一致。

综上所述，孤独症的发病可能与细胞因子的表达水平异常有关，高压氧干预治疗可降低IL-1β、IL-6、IL-10 水平，从而改善孤独症大鼠的生长发育及社会行为。

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