人水通道蛋白4胞外区的原核表达及纯化*

张迎娜，高 峰，方 华，赵 雪，张 婧，杜 英，潘卫东#

1)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室 郑州450001 2)河南省医药科学研究院神经免疫学研究室 郑州450052 3)郑州市神经免疫学重点实验室 郑州450052

视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一种免疫介导的特发性中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，主要损伤视神经和脊髓［1］。2004年Lennon 等［2］使用间接免疫荧光方法(IIF)在NMO 患者的血清中发现了一种能与小鼠小脑、中脑组织选择性结合的自身抗体，称为NMO-IgG。2005年Lennon 等［3］用免疫双标法进一步证实与NMO-IgG 特异性结合的靶抗原为水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)，并将其抗体称为抗AQP4 抗体。2006年修订的Wingerchuk 标准［4］将AQP4 抗体阳性作为NMO 的诊断标准之一。AQP4 是六次跨膜蛋白，C 端和N 端均在胞内，含有3个胞外环(A、C、E 环)和两个胞内环(B、D 环)，胞外环为AQP4 抗体结合的特异性位点［5-7］，因此表达AQP4 的胞外区蛋白有望为NMO 的体外诊断提供原料。该研究利用基因工程手段构建了表达pET32a(+)-AQP4 胞外区的融合蛋白，并进行了纯化，以期为进一步研究AQP4 胞外区在诊断NMO 方面的应用奠定基础。

1 材料与方法

1．1 菌株及质粒 质粒pUC18 购自宝生物工程(大连)有限公司，质粒pET32a(+)购自Novagen 公司，大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)均由郑州大学生物工程系细胞生物学研究室馈赠。

1．2 主要试剂 限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA 连接酶、DNA marker、凝胶回收试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司，质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，蛋白Marker、咪唑和氨苄青霉素钠均购自Genview 公司，IPTG 购自Solarbio 公司，鼠抗组氨酸单克隆抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司，HRP 标记的羊抗鼠IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ECL 发光液购自碧云天生物技术公司，Ni-NTA 亲和层析柱由作者自行装柱。

1．3 基因的设计及合成 根据GenBank 中登录的AQP4 基因序列(NP_001641．1)，利 用TMHMM Server V2．0 生物软件在线分析AQP4 蛋白质结构，通过Blast 比对出AQP4 胞外区的基因序列，根据后续实验的需要及大肠埃希菌“密码子偏嗜性”设计并合成6 条寡核苷酸单链，由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列见表1(仅列3 条)。

1．4 目的基因的克隆及鉴定 将合成的互补寡核苷酸单链先用灭菌双蒸水溶解，在PCR 仪上95℃变性5 min 后自然冷却至室温，形成双链DNA。用BamHⅠ、Hind Ⅲ分别双酶切双链DNA 和pUC18 质粒，回收AQP4 胞外区基因片段和pUC18 质粒片段，按目的基因与载体按物质的量比为3∶1 的比例，用T4 DNA 连接酶16℃连接18 h。连接产物用热激法转化感受态大肠杆菌DH5α，同时以空质粒和灭菌双蒸水进行转化作为对照，涂布于含有IPTG、X-gal、50 mg/L 氨苄青霉素的LB 固体培养基上，37℃恒温箱培养16～18 h，挑取白色阳性单个菌落，于37℃200 r/min 摇床上摇菌过夜，用质粒小量提取试剂盒提取重组质粒进行双酶切鉴定，同时将重组质粒送上海生工生物工程股份有限公司进行测序，并进行序列比对分析。

表1 寡核苷酸单链序列*

1．5 重组表达质粒的构建 用BamHⅠ、Hind Ⅲ分别双酶切重组克隆质粒pUC18-AQP4 胞外区和表达载体pET32a(+)，切胶回收目的基因片段和载体片段，目的基因与载体按物质的量比为3∶1 的比例在T4 DNA 连接酶的作用下于16℃连接18 h。连接产物采用热激法转化感受态DH5α，涂布于含有50 mg/L 氨苄青霉素的LB 固体培养基上，37℃培养16～18 h。挑取单个阳性菌落进行鉴定，方法同1．4。

1．6 目的基因的诱导表达 将测序正确的重组表达质粒采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，涂布于含有50 mg/L 氨苄青霉素的LB 固体培养基上，37℃培养16～18 h。挑取单个菌落接种于25 mL 含有50 mg/L 氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37℃培养过夜，次日取菌悬液1 mL 加入到100 mL 新鲜的LB 培养基中，37℃200 r/min 振荡培养至D600nm为0．4～0．6 时，加入IPTG 至终浓度为1 mmol/L，30℃诱导8 h，收集菌液，12 000 r/min 4℃离心20 min，收集菌体，用PBS 缓冲液重悬，冰浴超声破碎(超声10 s，间歇5 s)，12 000 r/min 4℃离心20 min，收集上清液后进行150 g/L SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白的表达情况。

1．7 重组蛋白的纯化 收集上述超声破菌后的上清液，以NTA 层析介质进行纯化，层析柱用Bio-Rad的1 mL 重力空柱，用Ni-NTA 填料自行装柱。第一步为柱平衡，用0．01 mol/L、pH 8．0 的PBS 缓冲液进行柱平衡;第二步为上样，将离心所得上清液进行上样，使其液体与柱子进行吸附15 min;第三步为柱平衡，用含20 mmol/L 咪唑的0．01 mol/L、pH 8．0的PBS 缓冲液进行柱平衡，除去未结合的杂蛋白或结合不牢的蛋白;第四步为洗脱，通过100、300 mmol/L 咪唑进行梯度洗脱，并分管收集样品。

1．8 重组蛋白的Western blot 鉴定 表达的重组蛋白经150 g/L 的SDS-PAGE 电泳分离后，利用湿转的方法转移至硝酸纤维素膜上，30 g/L 的BSA 封闭液封闭2 h，加入一抗(鼠抗组氨酸单克隆抗体，按1∶2 000 稀释)，4℃冰箱孵育过夜，次日摇床上用TBST 缓冲液洗涤3次，10 min/次;再加入酶标二抗(HRP 标记的羊抗鼠IgG，按1∶10 000 稀释)，摇床上室温孵育2 h，用TBST 洗涤3次，10 min/次，暗室中ECL 曝光1 min 后进行显影和定影。

2 结果

2．1 AQP4 3个胞外区形成双链DNA 后的鉴定AQP4 胞外区寡核苷酸单链经变性退火后行20 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析，可见约100 bp 的特异性条带，见图1。

图1 AQP4 胞外区双链DNA 电泳图

2．2 AQP4 3个胞外区克隆质粒的鉴定 重组克隆质粒的双酶切产物经20 g/L 琼脂糖凝胶电泳，可见约100 bp 的目的条带，与预期大小一致，见图2。测序结果与AQP4 胞外区基因完全一致。

2．3 AQP4 3个胞外区表达质粒的鉴定 重组表达质粒的双酶切产物经20 g/L 琼脂糖凝胶电泳，可见约100 bp 的目的条带，与预期大小一致，见图3。测序结果与AQP4 胞外区基因完全相符。

2．4 表达产物的鉴定 表达的重组蛋白经150 g/L的SDS-PAGE 电泳分离后，在相对分子质量约为26 000处可见特异性蛋白条带，大小与预期相符，见图4。

图2 质粒pUC18-AQP4 胞外区的双酶切鉴定

图3 质粒pET32a(+)-AQP4 胞外区的双酶切鉴定

图4 重组蛋白的SDS-PAGE 分析

2．5 纯化产物的鉴定

图5 纯化的AQP4 SDS-PAGE 分析

2．5．1 SDS-PAGE 分析 纯化的蛋白经150 g/L 的SDS-PAGE 电泳分离后，在相对分子质量约26 000处可见特异性蛋白条带，纯度约为75%，见图5。

2．5．2 Western blot 分析 见图6。检测结果显示，表达纯化的融合蛋白pET32a(+)-AQP4 胞外区均可与鼠抗组氨酸单克隆抗体特异性结合，在相对分子质量约为26 000 处可见明显特异性条带。然而用AQP4 抗体阳性的血清作为一抗进行Western blot，发现胞外区蛋白未被血清中的AQP4 抗体特异性识别。

图6 表达产物的Western blot 分析

3 讨论

AQP4 是水通道蛋白家族的成员，也是中枢神经系统重要的水通道蛋白，在哺乳动物脑内有大量的表达，主要表达于室管膜细胞和星形胶质细胞的轴突、足突上，参与脑内水平衡调节，因此，AQP4 与脑水肿的相关报道也是层出不穷［8-10］。然而自AQP4 被确定为区别多发性硬化与NMO 的特异性抗体的靶抗原以来，对AQP4 在作为体外检测NMOIgG 抗体原料应用方面的研究也陆续地被报道:如以组织为底物的IIF［2］，以细胞为底物的IIF［11-12］、放射免疫沉淀法［13］、荧光免疫沉淀法［14］、酶联免疫吸附试验［15］、流式细胞术［16］及Western blot［17］，但灵敏度或特异度低、操作繁琐、费用昂贵等原因限制了其在国内大规模的推广和应用，因此建立一种适合国人NMO 的检测方法非常必要。

原核表达系统遗传背景清楚、培养方法比较简单、经济、蛋白表达量高、易于大规模工艺化生产，且技术已相当成熟，因此成为目前应用最广泛的蛋白质表达系统之一。但由于缺乏合适的翻译后加工机制，表达的产物不能进行翻译后修饰，从而不能有效地折叠形成复杂的空间结构，且利用大肠杆菌表达外源蛋白时很难获得大量的可溶性蛋白，而蛋白的可溶性是保证蛋白生物活性的先决条件。Trx A 是大肠杆菌的自身蛋白，具有热稳定性及氧化还原作用，作为融合标签可以促进蛋白的可溶性表达，并能辅助蛋白二硫键的形成及正确折叠。通常情况下在大肠杆菌中以包涵体形式表达的蛋白通过与Trx A标签融合表达，均可以获得可溶性的表达蛋白［18-19］。该研究通过Trx A 与AQP4 胞外区的融合表达成功获得了可溶性表达的AQP4 胞外区，且在pET32a(+)载体中存在6个组氨酸标签，利用Ni2+亲和层析柱具有吸附6个组氨酸标签的高度特异性，通过一步亲和层析也可达到较高的纯度。

该研究表达的AQP4 3个胞外融合蛋白通过ExPASy 软件在线预测其相对分子质量约为23 000，然而在经SDS-PAGE 电泳分离后发现融合蛋白的相对分子质量均在26 000 左右，这可能是组氨酸标签的原因［20］:因为组氨酸是碱性氨基酸，且是带正电荷的，而载体中的组氨酸标签中含有6个连续组氨酸，带有大量的正电荷，降低了蛋白在SDS-PAGE 中迁移的速度，导致了蛋白质表观相对分子质量与实际相对分子质量存在一定的偏差。

利用表达的AQP4 胞外区蛋白与筛选的AQP4抗体阳性血清进行Western blot，发现表达蛋白未被抗体特异性识别，作者推测其中的原因可能是仅表达胞外区不能形成三维空间结构，而抗体识别的是蛋白的三维空间结构，但这一推测有待进一步验证。

总之，该研究完成了AQP4 胞外区与Trx A 的可溶性融合表达，为后续进行AQP4 胞外区的生物活性研究奠定了基础。

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