亲水作用色谱-电雾式检测用于5 种抗病毒药物的定量分析

龙 珍 ， 金 燕， 刘晓达， 郭志谋 ， 沈爱金， 胡兴娟， 吴宁鹏

（1. 赛默飞世尔（中国）科技有限公司，北京100080；2. 中国科学院分离分析化学重点实验室，中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连116023；3. 河南省兽药饲料监察所，河南 郑州450008）

病毒性疾病是目前世界上发病率最高的疾病之一，严重威胁着禽类、兽类，甚至人类的生命安全。为了有效预防和控制病毒性疾病的发起和传播，需要根据不同的发病机理针对性地使用不同的抗病毒药物［1，2］。病毒性疾病起因复杂多样，因此市面上的抗病毒药物也多种多样，如三环胺类抗病毒药物金刚乙胺等；核苷类抗病毒药物阿昔洛韦、利巴韦林等。病毒性疾病的控制和预防往往需要多种抗病毒药物同时使用。发展多种抗病毒药物的同时分离分析和定量方法，有利于研究药物代谢机理、监测禽类产品中抗病毒药物的残留。

利巴韦林、更昔洛韦［3］、泛昔洛韦［4，5］、伐昔洛韦［6］和金刚乙胺是常见的抗病毒药物。然而，要实现这几种药物的同时分离、检测较为困难。电离状态下的金刚乙胺极性较强，反相色谱模式中保留较弱。为了增强金刚乙胺在反相色谱柱上的保留，常用碱性溶液作流动相。但即使在游离状态下，由于金刚乙胺分子的强极性，反相色谱保留仍然较弱。亲水作用色谱（HILIC）是反相色谱的有力补充［7-15］，可为极性化合物提供较好的保留和独特的分离选择性。金刚乙胺［16-18］和利巴韦林［19］的紫外吸收较弱，需要在低波长下或者衍生的情况下才能用紫外检测器检测。衍生方法具有较高的灵敏度，但该方法操作复杂，重复性较差，并且不是所有的化合物都具有衍生所需的基团。电雾式检测器（CAD）和质谱等通用型检测器是紫外检测器的有力补充，可以提高紫外吸收较弱化合物的检测灵敏度，并且不需要繁琐的衍生步骤。质谱可为抗病毒药物的检测提供较高的灵敏度［20］，但其价格昂贵、操作复杂、定量稳定性和准确性受诸多因素的影响。CAD 是近年来发展起来的一种通用型检测器，该检测器操作简单且具有较高的检测灵敏度和较宽的线性范围［21-26］。

本文以亲水色谱柱Click TE-Cys［27，28］为固定相，CAD 为检测器，发展了一种可实现5 种抗病毒药物同时分离的液相色谱方法。与反相液相色谱方法和其他HILIC 方法相比，该方法具有较好的峰形和分离选择性，可实现5 种抗病毒药物的同时分离和定量分析。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

乙腈（色谱纯，ThermoFisher 公司）；甲酸（FA，纯度99%）、甲酸铵（纯度99.9%）（Acros 公司）；利巴韦林（德国Dr. Ehrenstorfer GmbH），泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦和金刚乙胺（中国振翔科技有限公司）。低压四元色谱系统（ThermoFisher 公司），配置LPG-3400SD 低压四元色谱泵、WPS-3000TSL 自动进样器、TCC-3200 柱温箱、VWD-3100紫外-可见波长检测器、Corona Veo RS 电雾式检测器、变色龙色谱管理软件Chromeleon 7.2。分析柱Acclaim C18 （150 mm×4.6 mm，5 μm）（ThermoFisher 公司）；ZIC-pHILIC （150 mm×4.6 mm，5 μm）（美国Merck 公司）；Click TE-Cys （150 mm×4.6 mm，5 μm）（中国科学院大连化学物理研究所）。

1.2 色谱条件

反相色谱分离以Acclaim C18 为色谱柱，流动相A 为乙腈，B 为0.1% （v／v）FA 水溶液，洗脱梯度为0 ～15 min，5% A ～18% A。以ZIC-pHILIC 为固定相的亲水色谱分离，流动相A 为乙腈，B 为10 mmol／L 甲酸铵（pH 2.9），洗脱梯度为0 ～30 min，90% A ～70% A。以Click TE-Cys 为固定相的亲水色谱分离，流动相A 为乙腈，B 为100 mmol／L 甲酸铵（pH 2.9），C 为水。流速：1 mL／min；柱温：30℃；紫外检测波长：254 nm。CAD 检测条件：蒸发温度35 ℃；过滤模式5；采集频率10 Hz；PFV（power function value）值1.3。

2 结果与讨论

2.1 检测器的影响

以Acclaim C18 为固定相，分别用CAD 和紫外检测器检测几种抗病毒药物的响应情况，如图1a 所示，利巴韦林的紫外吸收较弱，在254 nm 波长下响应较小；金刚乙胺无法用紫外检测器直接检测。因此无法用紫外检测器同时检测5 种抗病毒药物。CAD 是一种通用型检测器，它是检测分析物颗粒表面的电荷量，适合半挥发和难挥发的化合物。CAD的响应与分析物的质量成比例，与分析物的光学性质无关。如图1b 所示，5 种抗病毒药物在CAD 中都有较好的响应。因此，在下面的分离模式和流动相条件优化过程中以CAD 为检测器。

2.2 分离模式及色谱柱的选择

图1 5 种抗病毒药物在（a）紫外-可见波长检测器和（b）CAD检测下的色谱图Fig.1 Chromatograms of the five drugs obtained with（a）a UV-Vis detector and （b）a CAD

以3 种不同色谱柱：亲水色谱柱（ZIC-pHILIC和Click TE-Cys）和反相色谱柱（Acclaim C18）为固定相进行抗病毒药物的分离，并以CAD 为检测器检测。如图2a 所示，在反相色谱模式中，金刚乙胺在死时间附近出峰，无法与死时间附近出峰的杂质分离。在C18 色谱柱上，泛昔洛韦和抗生素水溶液中一杂质共洗脱，无法实现泛昔洛韦的定量分析。亲水色谱模式是反相色谱模式的有力补充。如图2b 所示，在ZIC-pHILIC 色谱柱上，金刚乙胺与杂质可以得到较好的分离。但5 种碱性抗病毒药物在ZIC-pHILIC 上都存在不同程度的拖尾和色谱峰展宽，导致分离度下降和检测灵敏度降低。如拖尾导致更昔洛韦和伐昔洛韦、利巴韦林和相邻杂质无法分离。此外，严重的拖尾和色谱峰展宽导致金刚乙胺检测灵敏度降低，甚至无法检测。与ZIC-pHILIC相比，以Click TE-Cys 为固定相时所有待检测物质都可以获得更好的峰形（不对称因子As＜1.3）、更窄的峰宽（半峰宽W1／2＜0.18 min）和更高的检测灵敏度。如以ZIC-pHILIC 为固定相，泛昔洛韦的峰高为21 pA；以Click TE-Cys 为固定相，泛昔洛韦的峰高为44 pA。与反相色谱分离相比，Click TE-Cys具有不同的分离选择性，5 种目标化合物均得到基线分离（分离度Rs＞1.5）。此外，在Click TE-Cys上可以分离检测到一些无法在反相色谱模式中分离的杂质，如图2c 中出峰时间为2.5、2.9、4.8 和8.5 min 的色谱峰。更好的分离度保证了各目标化合物更准确的定量。与蒸发光散射检测器（ELSD）一样，CAD 的响应随流动相中有机相含量的增加而增加。反相色谱流动相中的乙腈含量远低于亲水色谱模式，因此5 种抗病毒药物在反相色谱模式中的响应低于在亲水色谱模式中的响应。以Click TE-Cys为固定相，分析物中峰高最高的化合物的峰高是反相色谱模式下最高峰高的5 倍。

图2 （a）Acclaim C18、（b）ZIC-pHILIC 和（c）Click TECys 分析5 种抗病毒药物的色谱图Fig.2 Chromatograms of the five drugs obtained with（a）Acclaim C18，（b）ZIC-pHILIC and （c）Click TE-Cys columns

2.3 流动相条件的优化

在HILIC 分离中，盐浓度和乙腈浓度对化合物的保留行为都有较为显著的影响。在盐浓度的优化实验中，保持缓冲盐的种类、pH（2.9）和乙腈梯度曲线不变，分别选取10、15 和20 mmol／L 甲酸铵（pH 2.9）作为缓冲盐，考察盐浓度对目标化合物分离的影响。如图3 所示，随着盐浓度的增加，化合物的保留时间稍有减少（＜1 min）。随着盐浓度的增加，化合物的选择性稍有变化，如利巴韦林、金刚乙胺以及介于两者之间的杂质。但无论用哪种盐浓度，都可以实现5 种抗病毒药物的分离。为了减少盐对检测灵敏度度的影响，选择10 mmol／L 甲酸铵（pH 2.9）为流动相添加剂。

图3 甲酸铵浓度对5 种抗病毒药物分离的影响Fig.3 Effect of ammonium formate concentration on separation of the five antiviral drugs

在乙腈浓度的优化实验中，分别选取85% ～75%、80% ～70%、75% ～65% 乙腈作为有机相梯度，同时保持流动相中缓冲盐种类、浓度和pH 值不变。如图4 所示，所有化合物的保留时间都随流动相中乙腈浓度的增加而增加。以伐昔洛韦为例，使用乙腈梯度85% ～75%、80% ～70%、75% ～65% 时，保留时间分别为5.5、8.0 和11.7 min。为了实现较快的分离且保证几种抗病毒药物及杂质间较好的分离，选择乙腈梯度为80% ～70%。

图4 乙腈梯度对5 种抗病毒药物分离的影响Fig.4 Effect of acetonitrile gradient on separation of the five antiviral drugs

2.4 线性范围和检出限

按照优化后的色谱条件，在0.07 ～2.28 mg／mL 范围内取5 个点，每个浓度进样3 次，每次进样5 μL。如表1 所示，以峰面积为纵坐标（A），质量浓度为横坐标（C，mg／mL），考察利巴韦林、更昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦和金刚乙胺的线性范围，并以S／N＝10 确定了5 种抗病毒药物的定量限。

表1 5 种抗病毒药物的线性关系及LOQTable 1 Linear relationships and LOQs of the five antiviral drugs

2.5 方法的重复性

以质量浓度为1.0 mg／mL 的金刚乙胺、利巴韦林、更昔洛韦、泛昔洛韦和伐昔洛韦混合溶液为样品，平行测定5 次，检测本方法的峰面积重复性（见表2）。本方法测定泛昔洛韦、金刚乙胺、利巴韦林、更昔洛韦和伐昔洛韦有较好的日内重复性（RSD≤3.06%）和日间重复性（RSD≤5.38%）。

表2 5 种抗病毒药物峰面积的日内（n＝5）和日间重复性（n＝3）Table 2 Intra-day （n＝5）and inter-day （n＝3）peak area repeatability of the five antiviral drugs

3 结论

本实验以Click TE-Cys 为固定相，CAD 为检测器，建立了多种抗病毒药物同时分离检测的方法。该方法可为所选药物提供良好的峰形和独特的分离选择性。考察了不同的检测器、色谱模式、色谱柱和实验条件对抗病毒药物的响应、峰形和分离选择性的影响，可为同类化合物的分离提供参考。本实验发展的方法具有较宽的线性和较高的灵敏度，可用于相关药物的定量、定性分析。

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