酵母多糖影响人朗格汉斯细胞C型凝集素受体的研究

傅方洁， 葛安兴， 孔令明， 徐 琪， 王雪莲*

(1．中国医科大学 临床三系，辽宁 沈阳 110122；2．中国医科大学基础医学院 病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110122；3．中国医科大学 临床二系，辽宁 沈阳 110122)



酵母多糖影响人朗格汉斯细胞C型凝集素受体的研究

傅方洁1， 葛安兴2， 孔令明3， 徐 琪1， 王雪莲2*

(1．中国医科大学 临床三系，辽宁 沈阳 110122；2．中国医科大学基础医学院 病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110122；3．中国医科大学 临床二系，辽宁 沈阳 110122)

探究酵母多糖(Zymosan)对人朗格汉斯细胞(Langerhans cells, LCs)C型凝集素受体(C-type lectin receptors, CLRs)的影响。收集健康志愿者血液样本，Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，CD14磁珠分选CD14+细胞，用含有GM-CSF(1 000 U/mL)、IL-4(1 000 U/mL)、TGFβ-1(10 ng/mL)的培养液诱导培养LCs, Zymosan刺激LCs，8、24 h后收集细胞。提取Zymosan实验组和对照组细胞RNA，实时RT-PCR分析5种CLRs(Dectin-1、Dectin-2、DC-SIGN、Mincle、MRC-2) mRNA的水平，扩增产物测序鉴定。共检测10个个体来源LCs在酵母多糖刺激后其CLRs mRNA变化的情况。在10组样本中，有6组Dectin-2受体mRNA较对照组增加(变化倍数≥2)，其中3组增加明显(变化倍数≥5)，最大增加倍数为20.91；有5组Mincle受体mRNA较对照组增加(变化倍数≥2)，其中4组增加明显(变化倍数≥5)，最大增加倍数为19.98；有1组MRC-2受体mRNA较对照组明显增加(变化倍数≥5)。Dectin-1和DC-SIGN受体mRNA没有增加。Zymosan能增加部分个体来源LCs内Dectin-2、Mincle和MRC-2受体mRNA的水平，而对Dectin-1和DC-SIGN受体mRNA的水平没有影响。本研究结果完善了Zymosan调节机体免疫功能的作用机制。

酵母多糖；朗格汉斯细胞；C型凝集素受体

酵母多糖(Zymosan)是从酵母的细胞壁中提取出来的一类大分子糖类聚合物，其主要成分是葡聚糖、甘露聚糖和几丁质[1-2]。近年研究发现Zymosan是一种有效的机体免疫调节剂，具有多种免疫调节功能，包括抗感染、抗肿瘤及免疫增强作用等[3-4]。朗格汉斯细胞(Langerhans cells,LCs)是一种广泛存在于人体皮下组织中的树突细胞(dendritic cells,DCs)[5]。在人体固有免疫中，LCs作为抗原提呈细胞，通过位于细胞上的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)[6-8]，在机体抗感染过程中发挥重要作用。C型凝集素受体(C-type lectin receptors, CLRs)是重要的PRRs之一，包括Dectin-1、Dectin-2、DC-SIGN、Mincle、MRC-2等，主要通过识别碳水化合物结构域(CRD)，激发人体非特异性免疫系统的防御功能[9]。已有研究表明Dectin-1能够识别β-(1,3)-葡聚糖结构，启动Syk/CARD9-Bcl-10-MALT1级联途径和非典型 NF-κB信号途径[10]，促进DCs成熟和Th1、Th17细胞的分化，从而加强机体免疫应答[11]； DC-SIGN则通过结合多种抗原表面的甘露糖、岩藻糖结构，参与DCs迁移与抗原呈递过程等，诱导T细胞活化，进而增强机体的免疫反应最终清除病原体[12]；而MRC-2属于甘露糖受体(mannose receptor，MR)，可参与抗原捕获，是一种抗原递呈相关受体[13]。Dectin-2和Mincle是近年来新发现的CLRs，主要在多种巨噬细胞和DCs表面表达[14]。其中Dectin-2具有甘露糖结构结合位点，能够识别白假丝酵母菌、结核分枝杆菌等多种微生物表面的甘露聚糖结构，活化下游Syk、PKCδ和CARD9-Bcl10-Malt1信号通路，释放TNF、IL-2、IL-10等多种细胞因子，并促进炎性小体激活，从而有效促进人体固有免疫功能[15]。Mincle除具有甘露糖结构识别位点外，还受脂多糖等炎性因子刺激，坏死细胞产生的SAP130同样可激活Mincle受体，从而减少炎症损伤[16]。表明Mincle除具有激发自身免疫的作用外，还有一定的免疫监视功能。本研究通过qRT-PCR方法检测Zymosan体外刺激的LCs内包括Dectin-1、Dectin-2、MRC-2、DC-SIGN和Mincle在内的5种CLRs mRNA变化的情况，探究Zymosan参与免疫调节的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI-1640培养基、小牛血清、Ficoll购自Fisher Inc.；CD14磁珠购自MiltenyiBiotec Co. Ltd.；rhGM-CSF、rhIL-4、TGF-β1购自PeproTech Inc.；Zymosan购自InvivoGen；RNA提取试剂盒购自Qiagen；DNase I购自Promega；引物由Beacon Design软件设计；SuperScript®III First-Strand Synthesis System购自Life Technologies。

1.2 方法

1.2.1 外周血CD14+单核细胞分离 收集健康志愿者血液样本10份，依次记为k1～k10组。应用Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(PBMCs)。应用CD14 Isolation Kit分离CD14+细胞。细胞计数后备用。

1.2.2 LCs诱导培养及Zymosan处理 用含有GM-CSF(1 000 U/mL)、IL-4(1 000 U/mL)、TGFβ-1(10 ng/mL)的RPMI-1640培养液诱导培养CD14+细胞(106个/mL)，第3天补加细胞因子，7 d后获得LCs。应用酵母多糖(10 μg/mL)刺激LCs，8和24 h后收集细胞备用。同时设阴性对照组。

1.2.3 RNA提取 用RNeasy kit提取Zymosan实验组和阴性对照组细胞的RNA，最后溶于30 μL无RNase水中。分光光度计测定RNA浓度。

1.2.4 实时RT-PCR分析CLRs的mRNA ①cDNA构建：应用SuperScript®III First-Strand Synthesis System去除RNA样品中RNase、DNA，构建cDNA。反应体系为20 μL，包括：10×buffer 2 μL，dNTP (10 mmol/L) 2 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2.8 μL，Oligodt (50 mmol/L) 0.25 μL，R hex (50 μmol/L) 0.5 μL，RNase OUT (40 U/μL) 0.2 μL，DNase (1 U/μL) 0.75 μL，双蒸水1.5 μL，RNA 10 μL(0.1 μg)。反应条件：37 ℃ 15 min；70 ℃ 12 min。每个反应体系加入0.5 μL SuperScript III反转录酶(200 U/μL)，逆转录反应条件：25 ℃ 10 min；50 ℃ 50 min；70 ℃ 15 min。②引物序列的设计及PCR扩增：应用Beacon Design软件设计所需引物，其序列见表1。PCR扩增反应按试剂盒说明书进行。以管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照，所有样本同时对目的基因和内参照GAPDH进行扩增，实时PCR结果以阈值循环数(cycle threshold，Ct)形式体现。反应体系体积12.5 μL：RNA free H2O 3.25 μL, SYBR Green 6.25 μL, 正向引物0.25 μL, 反向引物0.25 μL。在对应的孔中加入10倍稀释的2.5 μL cDNA。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s，40个循环。③数据计算及分析：共检测10个个体来源LCs在酵母多糖刺激后其受体mRNA变化的情况。以GAPDH为内参照，比较相同RNA样品中目的基因的量。采用Ct相对定量法，即表达量倍数的变化用目的基因量=2-ΔΔCt法计算。ΔΔCt=(Ct目的基因-CtGAPDH)实验组-(Ct目的基因- CtGAPDH)对照组。目的基因量表示样本中目标cDNA表达量相对于相应的空白对照组的变化倍数。设定空白对照ΔΔCt=0, 空白对照组相应的基因量=1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 扩增产物的鉴定 配制琼脂糖凝胶，取PCR扩增产物加样于琼脂糖凝胶孔道中，电泳后回收，测序鉴定。

2 结果与分析

2.1 Zymosan对Dectin-2受体mRNA的影响

在检测的10组样本中，有6组Dectin-2 mRNA在8或24 h时较对照组增加(增加倍数≥2)，刺激24 h的样本Dectin-2 mRNA均高于刺激8 h的样本，其中k3、k5、k10三组增加明显(增加倍数≥5)，最大增加倍数为K10组刺激24 h时，可达20.91倍(图1)。结果提示Zymosan可增加部分个体来源的LCs表面Dectin-2受体mRNA水平，推测Zymosan可能通过上调Dectin-2受体的表达，增强机体的免疫应答。

2.2 Zymosan对Mincle受体mRNA的影响

在检测的10组样本中，有5组Mincle受体mRNA在8或24 h时较对照组增加(变化倍数≥

图1 Zymosan对LCs Dectin-2受体mRNA的影响Fig.1 The Dectin-2mRNA in LCs stimulated by Zymosan

2倍)，刺激24 h时Mincle受体mRNA均高于刺激8 h时，其中k6、k8、k9、k10四组增加明显(变化倍数≥5倍)，最大增加倍数为K8组刺激24 h时，可达19.98倍(图2)。结果提示Zymosan可增加部分个体来源的LCs表面Mincle受体mRNA水平，推测上调Mincle受体的表达可能是Zymosan增强机体免疫应答的机制之一。

图2 Zymosan对LCs Mincle受体mRNA的影响

2.3 Zymosan对MRC-2受体mRNA的影响

在检测的9组样本中，有1组MRC-2受体mRNA在8 h时较对照组明显增加(变化倍数≥5倍，图3)，24 h时各组表达均无明显变化。结果提示Zymosan可刺激部分个体来源LCs表面MRC-2受体表达上调，还提示MRC-2可能在Zymosan调节机体免疫反应的早期阶段发挥作用。

图3 Zymosan对LCs MRC-2受体mRNA的影响

2.4 Zymosan对Dectin-1和DC-SIGN受体mRNA的影响

检测的10组样本在刺激8和24 h后，Dectin-1和 DC-SIGN受体mRNA的水平均无增加(图4、图5)。提示Zymosan可能不通过改变这两种受体的表达数量参与免疫应答。

图5 Zymosan对LCs DC-SIGN受体mRNA的影响Fig.5 TheDC-SIGNmRNA in LCs stimulated by Zymosan

3 讨 论

近年来，Zymosan对免疫系统的多种活性作用成为研究热点。Zimmermann等[17]通过Zymosan体外刺激培养的小鼠胸腺细胞和脾淋巴细胞发现：Zymosan与αCD3、PLPp等联合使用，能够有效促进这些固有免疫细胞分泌促炎细胞因子、IL-6、IFN-γ等。Wei等[18]应用人体细胞的实验研究发现Zymosan可通过刺激DCs产生大量GM-CSF、TNF-α等细胞因子促进Th1 和Th17细胞的激活，从而有效增强人体免疫应答。在进一步的免疫机制研究中，Yang等[19]发现Zymosan体外刺激小鼠肥大细胞，其细胞表面Dectin-1表达在刺激3 h时显著增加，而6 h时下降，提示Zymosan可能通过改变免疫细胞表面受体数量参与免疫调节。Gonzalo等[20]发现DC-SIGN受体在Zymosan刺激后的DCs表面重排并介导细胞间黏附，提示DC-SIGN重排可能是Zymosan调节免疫反应的机制。

由此推测，Zymosan可能通过与免疫细胞表面多种CLRs作用，改变CLRs表达情况，如数量或分布方式，或者改变其与细胞CLRs结合的能力，达到免疫调节的目的。Mincle和Dectin-2是近年来新发现且研究较多的CLRs，在DCs表面表达，能够识别甘露糖结构并促进多种细胞因子的分泌[21-22]。因此，Mincle和Dectin-2很可能作为Zymosan作用的受体参与人体非特异性免疫应答。本研究结果显示，Zymosan增加部分个体来源LCs内Mincle、Dectin-2 和MRC-2 mRNA的水平，提示细胞表面多种受体的表达增加，利于识别并结合更多抗原，开启下游信号通路，促进多种细胞因子产生，增强机体的免疫应答。这可能是Zymosan发挥免疫调节作用的机制之一。

本研究检测了Zymosan刺激LCs后8和24 h这两个时间点细胞内Dectin-1 mRNA的水平，结果显示Dectin-1无明显增加(图4)，结合Marshall[18]等对小鼠肥大细胞的实验结果分析，即Dectin-1表达在Zymosan作用后3 h增加，而6 h下降，推测Dectin-1可能参与Zymosan刺激早期的免疫反应(0～6 h)，而在后期(8～24 h)无明显反应。也可能是LCs和肥大细胞两种不同的免疫细胞对Zymosan的反应不同。同时在检测中发现，Zymosan刺激LCs后，其表面MRC-2表达在8 h时明显高于24 h，推测MRC-2可能也参与早期免疫反应。Zymosan不能刺激DC-SIGN的水平增加(图5)，间接佐证了Zymosan通过刺激免疫细胞表面DC-SIGN重排而非数量增加参与免疫反应。

本研究证实Zymosan能够明显增加部分个体来源LCs内Dectin-2、Mincle和MRC-2的水平，且间接佐证了其对Dectin-1和DC-SIGN的刺激作用，本研究结果进一步完善了Zymosan调节机体免疫反应的机制，即通过改变免疫细胞表面CLRs的受体数量或分布方式达到免疫调节的目的。研究结果也提示Zymosan可能作为临床辅助治疗药物或免疫佐剂的发展方向。

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The Impact of Zymosan on C-Type Lectin Receptors on Human Langerhans Cells

FU Fang-jie1, GE An-xing2, KONG Ling-ming3, XU Qi1, WANG Xue-lian2

(1.ThirdDept.ofClinic.Med. 98K, 2.Teach. &Res.Div.ofPathog.Organism,Coll.ofBasicMed.Sci.,3.SecondDept.ofClinic.Med. 98K,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122)

The impact of zymosan on C-type lectin receptors (CLRs) on human Langerhans cells (LCs) was investigated. Blood samples from healthy volunteers were collected, and PBMCs were isolated using Ficoll lymphocyte isolating liquid, and CD14+cells were isolated using CD14 microbeads. The LCs were induce-cultured in medium liquid containing GM-CSF (1 000 U/mL), IL-4 (1 000 U/mL), TGFβ-1 (10 ng/mL); LCs were stimulated with zymosan and collected the cells after 8 h and 24 h. RNA was extracted from zymosan group and control group, then the levels of 5 CLRs (Dectin-1, Dectin-2, DC-SIGN, Mincle, MRC-2) mRNA were analyzed by real-time RT-PCR, the amplified products were identified by sequencing. The variances of CLRs mRNA of a total 10 individuals LCs after stimulated with zymosan were determined and tested. The results showed that among the 10 samples, 6 groups Dectin-2 receptor mRNA increased as compared with the control group (variance times ≥2), among them 3 groups significantly increased (variance times ≥5), the largest increasing times was 20.91; 5 groups Mincle receptor mRNA increased as compared with the control group (variance times ≥2), among them 4 groups significantly increased (variance times ≥5), the largest increasing times was 19.98; 1 group MRC-2 receptor mRNA significantly increased as compared with the control group (variance times ≥5). Dectin-1 and DC-SIGN receptor mRNA were not increased. Therefore, zymosan can increase part of individual mRNA levels of Dectin-2, Mincle and MRC-2 receptor mRNA in LCs and has no effect on mRNA levels of the Dectin-1 and DC-SIGN receptor. This study perfected the mechanism of zymosan on regulating immune response.

zymosan; Langerhans cells; C-type lectin receptor

国家自然科学基金项目(81472439,81101989)

傅方洁 女,七年制本科在读。研究方向为人乳头瘤病毒相关疾病的生物治疗。E-mail: ffj0324@hotmail.com

* 通讯作者。女，副教授。研究方向为人乳头瘤病毒相关疾病的生物治疗。E-mail：wxlcmu@hotmail.com

2015-04-29；

2015-06-07

Q539

A

1005-7021(2015)06-0069-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.013