连夏配方颗粒对心梗后大鼠心肌组织酪氨酸羟化酶mRNA、乙酰胆碱酯酶mRNA表达的影响

·论著·

作者单位：100029 北京中医药大学[李家立(博士研究生)、田辰、郝腾、马娜娜(硕士研究生)]；北京中医药大学第三附属医院心内科(李平、白芳芳、刘卫宁)，重症监护室(马洪皓)

连夏配方颗粒对心梗后大鼠心肌组织酪氨酸羟化酶mRNA、乙酰胆碱酯酶mRNA表达的影响

李家立李平马洪皓田辰郝腾白芳芳刘卫宁马娜娜

【摘要】目的观察连夏配方颗粒对心肌梗死后大鼠心梗周围区心肌组织酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)mRNA与乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AchE)mRNA表达的影响。方法将90只健康雄性成年Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、美托洛尔组、连夏配方颗粒189.00 mg/kg、94.50 mg/kg、47.25 mg/kg组；假手术组只穿线，不结扎左冠状动脉前降支，余各组均结扎左冠状动脉前降支以建立急性心肌梗死大鼠模型；假手术与模型组大鼠予生理盐水灌胃，余各组均予相应实验药物；连续给药30天后，采用Real-time RT-PCR方法检测心梗周围区心肌TH mRNA与AchE mRNA表达水平。结果与假手术组比较，模型组大鼠心梗周围区心肌组织TH mRNA与AchE mRNA表达均明显增高(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，连夏配方颗粒189.00、94.50、47.25 mg/kg组大鼠心梗周围区TH mRNA与AchE mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01)；与美托洛尔组比较，连夏配方颗粒189.00 mg/kg组大鼠心梗周围区TH mRNA与AchE mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论连夏配方颗粒可显著降低心肌梗死后大鼠心梗周围区心肌组织TH mRNA与AchE mRNA的表达，达到改善心肌梗死后大鼠心梗周围区自主神经重构的作用。

【关键词】连夏配方颗粒；心肌梗死；自主神经重构；酪氨酸羟化酶；乙酰胆碱酯酶

基金项目：国家科技支撑计划(2007BAI10B02-07)；北京中医药大学自主选题(2013-ZYLC-015)；北京中医药大学自主选题(2013-JYBZZ-XS-170)

作者简介：李家立(1985- )，2012级在读博士研究生。研究方向：中医药防治心血管系统疾病。E-mail：lijiali5678@163.com

通讯作者：李平(1965- )，女，博士，主任医师，博士生导师。研究方向：中医药防治心血管系统疾病。E-mail：pearll2008@126.com

【中图分类号】R285.5

收稿日期：(2015-01-02)

Effects ofLianXiaFormula Granule on TH mRNA and AchE mRNA expression level in rats after myocardial infarctionLIJia-li，LIPing，MAHong-hao，etal.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

Correspondingauthor:LIPing，E-mail：pearll2008@126.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of LianXia Formula Granule(LXFG) on TH mRNA and AchE mRNA expression level at infarcted border zone of rats after myocardial infarction(MI). MethodsNinty healthy adult male Wistar rats were randomly assigned to six groups:sham operated group，model group，metoprolol group，189.00 mg/kg-dose of LXFG group，94.50 mg/kg-dose of LXFG group、47.25 mg/kg-dose of LXFG group.The sham operated rats were not ligated in the left anterior descending coronary artery except the rest groups.The sham operated group and model group were given with normal saline by intragastric administration,and the rest groups were given with medicine for testing by intragastric administration.Thirty days later, TH mRNA and AchE mRNA expression level were separately measured in all groups. ResultsCompared with the model group, TH mRNA and AchE mRNA expression level in the 189.00，94.50，47.25 mg/kg-dose of LXFG group decreased(P<0.05 or P<0.01).Compared with the metoprolol group,TH mRNA and AchE mRNA expression level in the 189.00 mg/kg-dose of LXFG group decreased(P<0.05 or P<0.01). ConclusionApplication of LianXia Formula Granule in rats after MI can significantly decrease the expression level of TH mRNA and AchE mRNA to improve cardiac autonomic neural remodeling.

【Key words】LianXiaFormula Granule；Myocardial Infarction；Cardiac Autonomic Neural Remodeling；Tyrosine hydroxylase；Acetylcholinesterase

在急性心肌梗死幸存的慢性人群中，仍有50%以上患者会死于致命性室性心律失常[1]。研究证实，心肌梗死发生后，在伴随心肌发生缺血、损伤、坏死和重构的同时，相同及周围区域的包括心交感神经与心迷走神经在内的心脏自主神经，也随之发生一定程度的损伤、坏死和重构，并在人体致命性心律失常的发生过程中起关键性作用[2-4]。而心肌梗死周围区则是心梗后组织修复、神经再生的敏感地带，较梗死区和非梗死区更加明显[5-6]。

本研究通过复制心肌梗死大鼠模型，连续灌胃给予实验药物，旨在观察中药小复方连夏配方颗粒对心肌梗死后大鼠心梗周围区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)mRNA与乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AchE)mRNA表达的影响，探讨连夏配方颗粒对心肌梗死后大鼠心梗周围区自主神经重构的干预作用。

1材料与方法

1.1实验动物

健康雄性清洁级42～49日龄Wistar大鼠90只，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2009-0007。

1.2主要药品与试剂

连夏配方颗粒由黄连、姜半夏中药免煎颗粒混合组成，均购买于北京中医药大学第三附属医院，均由北京康仁堂药业有限公司生产并提供质检报告。根据连夏配方颗粒原方比例(黄连∶姜半夏=1∶1)、黄连与姜半夏的煎煮浓缩工艺及人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表法计算得到：大鼠连夏配方颗粒等效剂量为94.50 mg/kg，作为本研究连夏配方颗粒中剂量组大鼠每天灌胃剂量；以中剂量的2倍，即189.00 mg/kg作为高剂量；以中剂量的0.5倍，即47.25 mg/kg作为低剂量。酒石酸美托洛尔片，生产批号：1103070C，阿斯利康制药有限公司。超纯RNA提取试剂盒(Cat#CW0581)、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(Cat#CW0744)、UltraSYBR Mixture(With ROX)(Cat#CW0956)、DNase 1(Cat#CW2090)、5xRNA Loading Buffe(Cat#CW0611A)等均购自CWbio.Co.Ltd。

1.3主要仪器

涡旋振荡仪(QL-902，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，离心机(Centrifuge 5415D，Eppendorf)，分光光度计(NANODROP 2000，Therno scientific)，荧光定量PCR仪(ABI7500，Applied Biosystems)。

1.4分组

将大鼠随机分为假手术组、模型组、美托洛尔组、连夏配方颗粒189.00 mg/kg、94.50 mg/kg、47.25 mg/kg组，每组15只。

1.5模型建立

动物模型参照文献[7]制备。用3.5 %水合氯醛10 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定于大鼠板上。在大鼠左侧第4、5肋间切口，打开胸腔，撕开心包，轻压胸廓挤出心脏，用0号手术线于肺动脉圆锥与左心耳下2 mm处结扎冠状动脉左前降支，立即将心脏放回胸腔，关闭切口，缝合皮肤，局部应用青霉素8万单位以防止感染。假手术组大鼠只穿线不结扎。

1.6给药

假手术组、模型组均给予生理盐水10 mL/kg灌胃，美托洛尔组给予美托洛尔100 mg/kg灌胃，连夏配方颗粒189.00 mg/kg、94.50 mg/kg、47.25 mg/kg组分别给予相应剂量连夏配方颗粒灌胃；建模当天即给药；均每天1次，连续给药30天；每天每只大鼠给予生理盐水的量均为10 mL/kg。

1.7指标检测和方法

连续灌胃给药30天后，除假手术组外其余各组大鼠均于心肌梗死周围区相同部位取心肌组织100 mg，假手术组大鼠于假手术操作处周围区相同部位取心肌组织100 mg，保存于-80℃。用Real-time RT-PCR方法检测心肌组织TH与AchE mRNA表达水平。引物序列见表1，实验步骤参照试剂盒说明书及文献[8-9]进行。

表1　引物序列

1.8统计学处理

2结果

2.1对心肌组织TH mRNA及表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死周围区心肌组织TH mRNA明显升高(P<0.05)。给药30天后，与模型组比较，美托洛尔组大鼠TH mRNA明显降低(P<0.05)；连夏配方颗粒189.00、94.50、47.25 mg/kg组大鼠TH mRNA均明显降低(P<0.05)。与美托洛尔组比较，连夏配方颗粒189.00 mg/kg组大鼠TH mRNA明显降低(P<0.05)。说明连夏配方颗粒可以改善心梗后大鼠心交感神经重构，上述差异均有统计学意义，见表2。

表2　连夏配方颗粒对心肌梗死大鼠心肌组织TH mRNA

注：与假手术组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较cP<0.05，dP<0.01；与美托洛尔组比较，eP<0.05，fP<0.01。

2.2对心肌组织AchE mRNA表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死周围区心肌组织AchE mRNA明显升高(P<0.01)。给药30天后，与模型组比较，美托洛尔组大鼠AchE mRNA变化不明显(P>0.05)；连夏配方颗粒189.00、94.50、47.25 mg/kg组大鼠AchE mRNA均明显降低(P<0.01)。与美托洛尔组比较，连夏配方颗粒189.00、94.50 mg/kg组大鼠AchE mRNA明显降低(P<0.01)。说明连夏配方颗粒可以改善心梗后大鼠心迷走神经重构，上述差异均有统计学意义，见表2。

3讨论

心脏自主神经包括交感神经和迷走神经，在对心脏独立的局部调节作用中，两者相反相成，共同协调完成对心脏节律、传导和收缩力等的直接调控。同时，体内各种机制还可以通过心脏自主神经对心脏发挥调节作用。

心脏自主神经对于心肌缺血缺氧损伤十分敏感。心肌梗死发生后，相同及周围区域的心脏自主神经亦发生损伤或坏死，且在形态和功能学都发生了不均一性重构，集中表现为梗死区心肌自主神经去支配状态与梗死周围区心肌自主神经高支配状态。而由此引发心电生理及复极离散系列性继发性紊乱，进而容易在人体发生致命性心律失常(如室速、室颤等)，且成为心梗后发生室速和心脏性猝死的关键性因素[2-4，10]。

TH位于去甲肾上腺素能神经纤维内，是去甲肾上腺素合成的限速酶，参与全部儿茶酚胺代谢的限速环节，且具有高度地特异性，因此常作为交感神经标志物，用于标记交感神经，检测交感神经分布情况[11-12]。AchE在心肌梗死后不同部位心肌中具有不同的活性，其不仅是评价迷走神经活性的指标，也是评价迷走神经分布支配的指标[13-16]。故二者常被分别用于标记心交感神经与迷走神经以探讨心梗后心律失常与神经重构的相关机制。

本实验结果表明，心肌梗死后，在心梗周围区心脏交感神经与迷走神经均发生了再生重构现象，形成了自主神经高支配状态；而中药小复方连夏配方颗粒可以显著降低心肌梗死后大鼠心梗周围区TH mRNA与AchE mRNA的表达水平，从而改善心肌梗死后大鼠心梗周围区交感神经与迷走神经的再生重构，但其具体作用机制尚需进一步研究。

参考文献

[1]Jardine DL，Charles CJ，Forrester MD，et al.A neural mechanism for sudden death after myocardial infarction[J].Clin Auton Res，2003，13(5):339-341.

[2]郭继鸿.交感神经重构[J].临床心电学杂志，2008，17(4)：311-316.

[3]Cao JM，Chen LS，KenKnight BH，et al.Nerve sprouting and sudden cardiac death[J].Circ Res，2000，86(7):816-821.

[4]喜杨，于彦伟，曲秀芬，等.心肌梗死后迷走神经重构及普奈洛尔对其作用的研究[J].中华心血管病杂志，2004，32(supplement2)：257-259.

[5]Wong SS，Bassett AL，Cameron JS，et al.Dissimilarities in the electrophysiological abnormalities of lateral border and central infarct zone cells after healing of myocardial infarction in cats[J].Circ Res，1982，51(4):486-493.

[6]Cabo C，Boyden PA.Electrical remodeling of the epicardial border zone in the canine infarcted heart:a computational analysis[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，284(1):H372-384.

[7]李贻奎，宁可永，梁嵘，等.大鼠冠状动脉结扎心肌缺血模型方法的改进[J].中国新药杂志，2005，14(4):427-428.

[8]杜金行，李腾飞，宋威江，等.血府逐瘀胶囊对AMI大鼠血清ICAM-1及肾脏组织ICAM-1 mRNA表达的影响[J].中华中医药杂志，2014，29(11):3534-3536.

[9]刘亚坤，何金波，陈海娥，等.血必净注射液对缺氧/复氧大鼠心肌TLR4-NF-Κb-TNF-α通路的影响[J].中国中西医结合杂志，2014，34(12):1463-1468.

[10]Zhou S，Chen LS，Miyauchi Y，et al. Mechanisms of cardiac nerve sprouting after myocardial infarction in dogs[J].Circ Res，2004，95(1):76-83.

[11]Chen PS，Chen LS，Cao JM，et al.Sympathetic nerve sprouting，electrical remodeling and the mechanisms of sudden cardiac death[J].Cardiovascular Research，2001，50(2)：409-416.

[12]Chen LS，Zhou S，Fishbein MC，et al.New perspectives on the role of autonomic nervous system in the genesis of arrhythmias[J].J Cardiovasc Electrophysiol，2007，18(1):123-127.

[13]Paes AM，Carniatto SR，Francisco FA，et al.Acetylcholinesterase activity changes on visceral organs of VMH lesion-induced obese rats[J].Int J Neurosci，2006，116(11):1295-1302.

[14]Cinca J，Bardají A，Carreo A，et al.Low incidence of ventricular arrhythmias induced by ischaemia at the borders of a chronic infarct in a model with local postinfarction denervation[J].Cardiovasc Res，1994，28(7):1018-1024.

[15]张春，喜斌.急性心肌梗死大鼠心肌乙酰胆碱酯酶活性的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(43)：8697-8699.

[16]Chow LT，Chow SS，Anderson RH，et al.The innervation of the human myocardium at birth[J].J Anat，1995，187(Pt1):107-114.

(本文编辑：董历华)