Atp5a1基因在新疆哈萨克族食管癌中的表达分析

Atp5a1基因在新疆哈萨克族食管癌中的表达分析

张景萍1， 李卉1， 孙晓宏2， 瓦热斯江·依不拉音2， 沙亚哈提·别尔克哈之1， 刘伊宁1，

李晓苗1， 来雯婷1， 杰别克·瓦提别克1， 美丽吾尔提·达吾列提汗1, 李惠武1

(新疆医科大学1基础医学院生物化学与分子生物学教研室, 乌鲁木齐830011;2附属肿瘤医院胸外科, 乌鲁木齐830011)

摘要：目的利用比较蛋白质组学方法获得差异表达蛋白，从中寻找与新疆哈萨克族食管癌发生、发展密切相关的基因，为新疆哈萨克族食管癌的早期诊断和治疗提供依据。方法利用二维凝胶电泳(2-dimensionelectrophoresis, 2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技术联用检测新疆哈萨克族食管癌癌组织与远端正常组织的差异表达蛋白,对其中表达上调的Atp5a1基因进行RT-PCR验证。结果2-DE结果显示新疆哈萨克族食管癌癌组织中Atp5a1明显可见，蛋白表达强度差异>1.5倍。RT-PCR验证结果显示，癌组织中Atp5a1 mRNA明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论Atp5a1基因的高表达和食管癌的发生、发展密切相关。

关键词：ATP5a1； 比较蛋白质组学； 食管癌

中图分类号：R34文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.07.007

[收稿日期：2014-10-24]

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金(2011211B22)

作者简介：黄莉(1980-)，女，硕士，主治医师，研究方向：肿瘤放射治疗。

基金项目：新疆维吾尔族自治区自然科学基金(2012211A062)

作者简介：马玉龙(1979-)，男，硕士，主治医师，研究方向:先心病基础研究。

Expression and analysis of Atp5a1 in kazakhs esophageal cancer in Xinjiang

ZHANG Jingping1， LI Hui1， SUN Xiaohong2， Waresijiang Yibulayin2， Shayahati Bieerkehazhi1，

LIU Yining1, LI Xiaomiao1, LAI Wenting1, Jiebieke Watibiekev1, Meiliwuerti Dawulietihan1, LI Huiwu1

(1BasicMedicalSchool,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofThoracic

Surgery,TheAffiliatedTumorHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo obtain differential expression proteins of Kazakhs esophageal cancer in Xinjiang by a comparative proteomics method to find closely related gene; to provide clues for early diagnosis and therapy of occurrence and development of Kazakhs esophageal cancer Xinjiang. MethodsTwo-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) were utilized for the identification of proteins differentially expressed between cancer and adjacent non-cancerous tissue. The differential expression of Atp5a1 was further verified by RT-PCR. Results2-DE results showed that kazakhs esophageal carcinoma tissue Atp5a1 clearly visible and the intensity of protein expression differences greater than 1.5 times in Xinjiang. RT-PCR validation results showed that cancer tissue Atp5a1 mRNA increased obviously, the difference was statistically significant (P<0.05). ConclusionOver expression of Atp5a1 gene might be a significant function of occurrence and development of Kazakhs esophageal cancer in Xinjiang.

Key words: Atp5a1; comparative proteomics; Esophageal Cancer

食管癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，其5年生存率<15%[1]。在新疆哈萨克族居民的食管癌发病率最高，发病率高达155.9/10万，死亡率(88.7/10万)远高于同地区其他民族(22.3/10万)[2]。肿瘤的发生、发展过程是一个多阶段、多种因素共同作用的结果。多数针对单个致病基因或蛋白质的分析，不能从整体水平阐述肿瘤的发生、发展过程。蛋白质组学是采用高通量技术来研究疾病发生、发展全过程中整体蛋白质水平变化的重要技术[3-5]。随着蛋白质组学的迅速发展，尤其是肿瘤蛋白质组学研究已在多种肿瘤中应用，其结果对发现新的肿瘤生物标记物和为恶性肿瘤这样难治性疾病的早期发现提供了广阔的前景。目前，蛋白质组研究的核心技术是以双相凝胶电泳为主的蛋白质分离技术和以质谱技术、生物信息学为主的蛋白质鉴定技术。本研究使用二维凝胶电泳(2-dimensionelectrophoresis, 2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ ionization time- of- flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS )技术联用检测新疆哈萨克族食管癌患者癌组织和远端正常组织，获得差异表达基因，扩大样本量进一步验证差异基因的表达水平，旨在为新疆哈萨克族食管癌的早期诊断和预防提供可用的分子标记。

1材料与方法

1.1材料选取13对匹配的哈萨克族食管癌患者癌组织及相距6 cm 以上的远端无癌正常组织，所有使用样品均来自新疆肿瘤医院胸外科2008 年1-6 月收治的病例，均为鳞癌，提取的组织经冷PBS 洗涤后放液氮中保存备用。

1.2方法

我读的并不是正儿八经的中等专业学校，实际上，那只是一所职业学校。到这所学校读书的学生，要边学习边到社会上打工，给刚刚成立的穷学校挣钱。听说，在美国和日本，这种学校叫职业训练班。上这种学校的学生，要比技术学校的学生低一等。学技术和有技术的人在当时的社会是受人尊敬的（这也是这座东北城市的传统）。

1.2.12-DE选取3对匹配的哈萨克族食管癌患者癌组织及正常组织各300 mg左右，用生理盐水清洗干净后，在液氮中研磨粉碎，按文献[6]的方法进行蛋白提取及定量后进行双向电泳。电泳上样量为100 μg，IEF为pH3-10 非线性胶条，Amersham公司产品(电泳条件：30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 8 h，500 V 4 h)，SDS-PAGE为12.5%的胶(15 mA/胶 30 min，30 mA/胶 至溴酚蓝离胶下沿0.5 cm)，采用AgNO3染色。

1.2.2MALDI-TOF鉴定单个蛋白质将差异蛋白点，切碎后在Eppendorf管中，用Trypsin (Promega)溶液做胶内酶解，37℃反应过夜，Ziptip(millipore)脱盐，具体操作按文献[7]方法进行。

1.2.3逆转录PCR(RT-PCR)选取10对匹配的哈萨克族食管癌患者癌组织及正常组织进行RT-PCR验证。采用TRIZOL 试剂一步提取细胞总RNA，RNA 提取物1 μg，逆转录为cDNA，取以上样品cDNA 2 μL，加入2×Buffer10 μL，引物各1 μL，加去离子水至20 μL，以20 μL 体系进行PCR 扩增。PCR 扩增条件及引物序列见表1。GAPDH 用于作内对照。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。用凝胶成像系统进行半定量分析，取目的基因条带和GAPDH 条带强度的比值作为目的基因的相对值。

表1　各基因的引物序列、PCR 产物片断大小和PCR扩增条件

1.3统计学处理用IMAGEMASTERTM(GE)进行两组之间的t-test分析，得到合乎统计学标准的蛋白质差异点。所有数据采用SPSS 17.0软件进行分析。基因差异表达量以均数±标准差表示，组间数据的比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1癌组织与正常组织差异表达2-DE图谱通过2-DE技术，得到了新疆哈萨克族食管癌癌组织和远端无癌正常组织的差异表达蛋白谱。蛋白表达强度差异>1.5倍者, 被认为差异蛋白, 做进一步质谱分析。图1显示Atp5a1 基因在癌组织中明显可见，而正常组中未见蛋白。

图1　差异表达蛋白Atp5a1局部放大图

2.2差异蛋白的质谱鉴定质谱分析获得蛋白点的相应肽质量指纹图谱，将肽质量指纹数据通过因特网在蛋白质序列库中进行搜索，在数据库中找到与其匹配的蛋白质，经过鉴定，该差异表达蛋白为Atp5a1(图2)。

2.3Atp5a1基因在癌组织中高表达的RT-PCR验证结果RT-PCR验证结果显示，食管癌癌组织中Atp5a1mRNA明显升高，癌组织中表达量为(139.92±24.86)，正常组织表达量为(72.83±19.52)，差异有统计学意义(P=0.048) 。结果与2-DE结果相符。电泳结果见图3， 癌组织与正常组织中Atp5a1 mRNA表达量结果见图4。

图2经质谱分析所得的肽指纹图谱(Atp5a1)

图3 Atp5a1 ( 403 bp)和GAPDH(298 bp)2%琼脂糖凝胶电泳图

a： 各样本的表达量

b： 两组平均值

图4癌组织与正常组织中Atp5a1的mRNA表达量

3讨论

肿瘤是一种多基因参与的复杂疾病，其发生最终都必须通过蛋白质来实现。食管癌的发病率目前已经居全国各类恶性肿瘤第5位，而新疆哈萨克族是食管癌的高发民族，因此早期诊断及复发的早期检测是其有效治疗的关键。随着蛋白质组学相关技术的迅速发展，人类对疾病的研究已经发展到了分子水平。比较蛋白组学更有助于在肿瘤组织和正常组织中检测出候选差异蛋白分子[8-10]。本研究利用比较蛋白组学技术建立了食管癌及临近正常组织之间的差异表达蛋白谱，选取其中有显著意义的基因进行mRNA水平的验证，并获得了一致的结果，为寻找早期诊断指标提供了依据，为未来哈萨克族食管癌的发病机制、诊断及治疗奠定基础。

Atp5a1基因编码是ATP合酶的α-亚基，ATP合酶是一个位于线粒体膜上的多亚基酶，Atp5a1基因缺失将会导致该酶失活，从而使细胞凋亡[11-12]。1956 年，学术界就提出假说，认为肿瘤细胞的线粒体功能损坏导致了肿瘤细胞中糖酵解速率的增加。之后的很多研究证实了该假设，并且证明在肺、肝、结肠肿瘤中，Atp5B 的表达均下降；Atp5a1在结肠癌细胞中表达也减少，并且其减少可能是癌细胞获得对5- 氟尿嘧啶抵抗力的原因[13-14]。近年，研究表明高水平的Atp5a1表达与某些SNPs和肿瘤基因P53(TP53)突变有关，高表达可加速宫颈上皮内瘤样病变(CIN)的发生，能促进肿瘤的进一步发展；相反，低表达可能促进基因的微卫星不稳定性 (MSI)肿瘤的发展。研究显示当Atp5a1基因和不同的抗原提呈细胞 (APC)基因位于同一染色体上时，能抑制肿瘤细胞的生长。在小鼠中，这2个基因都位于18号染色体上；而在人类中，Atp5a1基因在18号染色体，APC则位于染色体5q21-22上[13]。

本实验结果显示，癌组织中Atp5a1基因在蛋白表达水平及mRNA水平均上调。说明在食管癌患者中，癌细胞可能正处在能量代谢旺盛的状态，推测Atp5a1可能在新疆哈萨克组食管癌的发生、发展过程中起重要作用。但本研究由于样本量有限，要进一步确定Atp5a1是否可作为新疆哈萨克族食管癌发生、发展过程中一个重要的调节剂，还需扩大样本量进行研究。同时，对Atp5a1基因的确切机制还需进一步研究其与TP53和APC基因的关系，可能获得新疆哈萨克族食管癌发生机制的重要信息。

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(本文编辑杨晨晨)

通信作者：王若峥，女，教授，主任医师，博士生导师，研究方向：肿瘤放射治疗及肿瘤免疫，E-mail：wrz8526@163.com。

通信作者：李晓梅，女，主任医师，硕士生导师，研究方向:冠心病基础研究，E-mail:LIXM505@163.com。

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