FISH检测孕早期胚胎停育和自然流产绒毛染色体异常的应用研究

FISH检测孕早期胚胎停育和自然流产绒毛染色体异常的应用研究

付娟娟1， 杨晨晨2， 胡小萍1

(1新疆维吾尔自治区人民医院病理科, 乌鲁木齐830000;2新疆医科大学, 乌鲁木齐830011)

摘要：目的探讨荧光原位杂交(FISH)技术诊断孕早期胚胎停育和自然流产绒毛染色体异常的临床应用价值。方法采用7种探针,应用FISH技术针对13、16、18、21、22号和X、Y染色体，对60例孕早期胚胎停育和自然流产绒毛组织进行检测分析,同时用30例人工流产绒毛作为对照。结果60例孕早期胚胎停育和自然流产绒毛组织中32例存在染色体数目异常，检出率为53.33%，其中15例16-三体，5例13-三体，4例22-三体，1例21-三体，10例三倍体。30例人工流产绒毛组织中检出染色体数目异常1例，为16-三体，检出率为3.33%，孕早期胚胎停育和自然流产绒毛组织染色异常检出率明显高于人工流产绒毛组织染色体异常，差异有统计学意义(P<0.05)。结论染色体数目异常是导致孕早期胚胎停育和自然流产的主要因素，其中16号染色体三倍体是主要改变，FISH技术可以快速、简便地检测出流产绒毛组织染色体异常。

关键词：早期胚胎停育； 自然流产； 染色体异常； 荧光原位杂交

中图分类号：R365文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.023

[收稿日期：2014-09-21]

基金项目：新疆医科大学创新基金(XJC2013124)

作者简介：郭莉(1979-)，女，硕士，主治医师，研究方向：妇产科超声诊断,E-mail：1476336277@qq.com。

A clinical research on chromosomal abnormality in early embryo damage and

spontaneous aborted fetuses detected by fluorescent in situ hybridization

FU Juanjuan1, YANG Chenchen2， HU Xiaoping1

(1DepartmentofPathology,ThePeople’sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion,

Urumqi830000，China;2XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the application value of detection the chromosome abnormalities of chorionic villi tissue of early embryo damage and spontaneous abortion by fluorescent in situ hybridization technology. MethodsSeven probes were used to detect 13, 16, 18, 21, 22 and X, Y respectively，and sixty cases of early embryo damage and spontaneous aborted fetuses chorionic villus were analyzed by FISH, and the results were compared with villi tissue from 30 cases of artificial abortion. ResultsThirty two of the sixty cases were found chromosomal numerical aberrations，and the detection rate was 53.33%, including fifteen cases of 16-trisomy, five cases of 13-trisomy, four cases of 22-trisomy, one case of 21-trisomy and ten cases of triploidy． One of the thirty cases of artificial abortion were found chromosomal numerical aberrations，and the detection rate was 3.33%, which was much lower than that of early embryo damage and spontaneous abortion group. The difference has statistical significance (P<0.05). ConclusionChromosomal numerical aberrations are the major factors for early embryo damage and spontaneous abortion, and the major change occurred in 16-trisomy. FISH analysis is a rapid and easy method in the detection of chromosomal abnormality in chorionic villus．

Key words: early embryo damage；spontaneous abortion; chromosome abnormality; fluorescent in situ hybridization

胚胎停育的发病原因有遗传因素、内分泌因素、感染、环境及其他因素。胚胎停育而引起的自然流产约占全部妊娠的10%～20%[1]，染色体异常被认为是胚胎停育及早期流产的主要原因。荧光原位杂交(FISH)技术作为一种近年兴起的生物学诊断技术已被广泛应用，其可以对染色体非整倍体进行快速准确地检测。本研究应用FISH技术，对60例孕早期胚胎停育和自然流产的绒毛以及30例人工流产的绒毛进行检测分析，探讨FISH技术检测早期胚胎停育和自然流产绒毛中染色体异常的应用价值。

1资料与方法

1.1研究对象选择2011年3月-2012年3月胚胎停育患者30例和自然流产患者30例及无异常人工流产绒毛30例，剔除子宫肿瘤、感染、外伤等明确流产诱因者。胚胎停育和自然流产孕妇平均年龄30岁，妊娠时间7～14 w，人工流产妇女平均年龄28岁，妊娠时间5～12 w。均行无菌操作清宫术，术后取绒毛组织进行FISH检测。

1.2主要仪器与试剂荧光显微镜、普通光学生物显微镜、荧光光源(Olympus公司)，离心机，电热恒温水浴箱，电子分析天平、烤片机(上海医疗器械设备厂)。缓冲液、DAPI复染剂(北京金菩嘉公司)，RNase A、胃蛋白酶、盐酸、胶原酶B(Sigma公司)，甲醇、冰乙酸、氯化钾、柠檬酸钠(北京化学试剂厂)。FISH 13、16、18、21、22、X、Y探针试剂盒(北京金菩嘉公司)。

1.3方法

1.3.1绒毛组织处理取流产绒毛组织，用生理盐水漂洗后剪碎，加入0.075 mol/L KCl 5 mL,37℃低渗20 min，再加入2 mL固定液(3∶1 甲醇∶冰醋酸)，吹打混匀后离心10 min，弃上清再固定2次，离心后去上清加入1 mL 冰醋酸消化后制备成细胞悬液，滴片。

1.3.2玻片制备将绒毛组织滴片后玻片室温干燥，于室温下2×SSC(缓冲液)溶液中漂洗5 min，0.08 mg/mL胃蛋白酶中37℃消化5 min，消化后依次置于70%、85%、100%乙醇中脱水各3 min，室温干燥。

1.3.3FISH检测按试剂盒提供的荧光原位杂交操作说明书进行操作，42%保温箱中过夜、洗片、复染后在荧光显微镜下观察。

1.4结果判读16号染色体(红色)/22号染色体(绿色)探针，正常细胞为2个红色、2个绿色信号；13号染色体(绿色)/21号染色体(红色)探针，正常细胞为2个红色、2个绿色信号；18号染色体(蓝色)/X染色体(绿色)/Y染色体(红色)，正常男性细胞中显示1个红色信号、1个绿色信号、2个蓝色信号，正常女性显示2个绿色信号、2个蓝色信号。每张玻片计数至少100个细胞，单独判断每种指标：正常细胞比例>90%，提示该指标正常；某指标异常细胞>60%，提示该指标异常；如正常细胞比例<90%且异常细胞比例<60%，则扩大计数至200个细胞。

2结果

90例流产绒毛组织，FISH成功率为100%。60例胚胎停育和自然流产绒毛组织中检出染色体数目异常32例，检出率为53.33%，其中15例16-三体(图1)，5例13-三体(图2),4例22-三体，其中1例13、16、21、22号染色体均有3个杂交信号(图3)，10例三倍体，FISH检测染色体异常见表1。人工流产绒毛组织30例，检出染色体数目异常1例，为16-三体，检出率3.33%。胚胎停育和自然流产绒毛与人工流产绒毛染色体异常检出率差异有统计学意义(P<0.01)。

图116-三体 16号染色体(红色)/22号染色体(绿色)探针

图213-三体 13号染色体(绿色)/21号染色体(红色)探针

图316-三体、22-三体 16号染色体(红色)/22号染色体(绿色)探针

3讨论

胚胎停育和自然流产一直是复杂的妇产科常见病，约占全部妊娠的12%～23%[1]。帮助胚胎停育和自然流产夫妇找到妊娠失败的原因可有效指导患者下一次成功妊娠，减轻其心理负担。胚胎停育和自然流产病因复杂，其中染色体异常被认为是胚胎停育和早期流产的主要原因[2-3]。

表1　FISH检测染色体异常类型

注: 其中有1例16、13、22、21号染色体均为三体。

染色体核型分析技术可以准确检测染色体结构和数目的异常，是目前染色体检测的金标准，但其缺点是检测方法繁琐、技术要求高、广泛普及难度大，而且其对标本要求高，需要足够的活性细胞和无菌条件，对于胚胎停育患者，若胚胎死亡时间较长，可能因无活性细胞而导致培养失败，成功率为91%～98%[4]。另外，核型分析检测时间长，一般需2～3 w，不能适应临床快速诊断要求。

目前荧光原位杂交(FISH)技术用于检测胚胎停育和自然流产绒毛组织13、16、18、21、22、X和Y染色体，其针对的是未经培养的细胞，对标本的要求较低，对于无活性的细胞和污染的标本也可以进行检测，而且FISH技术的操作相对简单，需要时间短，24 h就可得到检测结果，并且FISH检测的特异性及敏感性都较好。

本研究显示,FISH检测成功率为100%，染色体异常检出率为53.33%，与文献[5-7]报道的结果一致。说明FISH方法可以有效地检出大部分染色体数目异常导致的孕早期流产及胚胎停育。而人工流产绒毛组织的检出率仅为3.33%，两者差异有统计学意义，表明染色体异常是胚胎停育和自然流产的主要原因。本研究中染色体异常以16-三体最常见，占所有染色体异常的46.88%，该结论与Baffero等[8]报道的16-三体的染色体异常是早期胚胎停育和自然流产的主要原因结果一致。染色体数目改变的主要原因是双亲之一的配子时或妊娠初期受精卵分裂时出现了染色体的不分离，而导致该染色体增加或减少了1条，而三倍体甚至是四倍体在流产胎儿中也较常见，这种染色体的异常可以源自新的突变或双亲之一的配子形成中的异常有丝分裂或精母细胞、卵母细胞减数分裂中异常，也可源自双受精等，这类染色体异常一般在孕8 w以前流产。

FISH技术优势较明显，可以弥补“ 金标准”染色体核型分析的不足，临床应用前景十分广阔 ，但其在检测染色体方面的缺陷是不容忽视的，最主要是其漏诊率较高，由于FISH探针是针对最常发生数目异常的染色体进行设计的，现阶段只能针对13、16、18、21、22、X/Y 6种常见的染色体数目异常信号进行诊断，不能对整个染色体组进行分析，如果是上述6种染色体之外的染色体数目异常，则不能检测而出现漏诊。另外目前用于FISH 检测的探针属于着丝粒探针，该类探针只能检测染色体数目异常，对染色体的结构改变不能做出诊断而出现漏诊[9-10]。所以目前FISH技术还不能完全取代核型分析技术，可建议患者核型分析联合FISH检测同时进行，二者的技术互补可弥补彼此的不足。

参考文献：

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(本文编辑杨晨晨)