基于多波长覆盖融合指纹图谱的大川芎片主要成分研究

基于多波长覆盖融合指纹图谱的大川芎片主要成分研究

唐爽1，包永睿1,2,3，孟宪生1,2,3，富力4，王帅1,2,3

(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连 116600；

3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600；4.大连富生天然药物开发有限公司，辽宁 大连 116600)

摘要：目的建立10批次大川芎片多波长融合高效液相色谱指纹图谱，在此基础上对大川芎片融合指纹图谱共有峰进行初步指认，构建大川芎片的全析指纹图谱为其全面的质量控制提供依据。方法采用高效液相色谱法对大川芎片进行检测，将不同波长下数据进行多波长融合得到10批大川芎片的融合指纹图谱，采用液质联用技术对融合指纹图谱中的共有峰进行初步结构鉴定。结果10批大川芎片融合指纹图谱共获得13个共有峰并与共有模式图相似度均>0.92，其中8个共有峰得到指认。结论本文通过多波长融合技术手段及HPLC-MS分析方法建立大川芎片全析指纹图谱，为大川芎片主要成分的质量控制提供依据，为规范中药制剂及其合理使用奠定基础。

关键词：大川芎片；多波长融合；指纹图谱；液质联用

基金项目：“十二五”“重大新药创制”科技重大专项(No.2013ZX09507005)

作者简介：唐爽，女，研究方向：药物分析，E-mail：707547627@qq.com

通讯作者：孟宪生，男，博士研究生，博士生导师，研究方向：中药组分配伍、代谢组学及药品质量分析，Tel：0411-85890185，E-mail：mxsvvv@126.com

中图分类号：R284.2文献标识码：A

Study on the main components of the Dachuanxiong Tablets based

on multiple wavelength coverage fusion fingerprint

TANGShuang1,BAOYong-rui1,2,3,MENGXian-sheng1,2,3,FULi4,WANGShuai1,2,3

(1.CollegeofPharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China；

2.LiaoningProvinceMulti-ComponentChineseMedicineEngineeringTechnologyResearchCenter，

Dalian116600，China；3.LiaoningProvinceModernTraditionalChineseMedicineResearchand

EngineeringLaboratory，Dalian116600，China;4.DalianFushengNaturalDrug

DevelopmentCo.,Ltd.，Dalian116600，China)

Abstract：ObjectiveTo set up the multi-wavelength fusion HPLC fingerprint of 10 batches of the Dachuanxiong Tablets,common peaks were preliminary identified on that basis,building the total analyzed fingerprint in order to provide a base for the comprehensive quality controlling of the drug.MethodsThe fingerprint under different wavelength for ten batches of Dachuanxiong Tablets were tested by HPLC-DAD and the active components was identified by HPLC-MS.ResultsA HPLC fingerprinting pattern of 10 batches of the Dachuanxiong Tablets was set up based on multi-wavelength fusion,which demarcated 13 common peaks,8 of which were confirmed,the similarity was more than 0.92 between the correlation coefficients of the 10 samples.ConclusionIn this article,with the method of multi-wavelength fusion and HPLC-MS,we established the total analyzed fingerprint of Dachuanxiong Tablets and provided the foundation for the quality controlling of the tablets,which laying a foundation to regulate traditional Chinese medicine preparations and its reasonable application.

Key words:Dachuanxiong Tablets；Multiple wavelength fusion；Fingerprint；HPLC-MS

大川芎片由天麻、川芎两味药材组成，经提取、精制等一系列工艺处理后制成，具有活血化淤、平肝熄风之功效，专门用于治疗各种头痛和眩晕，疗效确切、毒副作用少，已广泛应用于临床。该制剂组方药材成分复杂，单一成分、单一波长测定不能全面、综合的评价其质量，因此建立综合、全面、有效的质量评价标准具有重大的意义。中药指纹图谱是中药质量控制的有效技术手段，大川芎片中的有效成分在单一波长下难以全面反映，故本研究采用多波长融合技术建立大川芎片多波长融合指纹图谱，并通过高效液相色谱-质谱联用技术对其化学成分进行分析，建立全析指纹图谱的质量控制体系，为大川芎片及中药制剂质量控制提供新的科学依据。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司，包括高压二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、Agilent 1100 色谱工作站)；HPLC-TOF-MS(美国安捷伦科技公司)。

1.2试药天麻素对照品(购于中国药品生物制品检定所，批号：110807-201306)；大川芎片(大连富生制药有限公司，批号：20120601、20121101、20130301、20130401、20130501、20130901、20131101、20140201、20140301、20140601)。乙腈(色谱试剂，Fisher公司，批号：110906)；甲酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20110409)；水为超纯水。

2方法与结果

2.1大川芎片多波长融合指纹图谱

2.1.1色谱条件Aglient TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.04%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0~10 min，2%-2%(B)，10~90 min，2%-24%(B)；流速：1.0 mL·min-1，柱温：30 ℃，检测波长：210、225、254、270、320 nm，进样量：10 μL[1]。

2.1.2对照品溶液的制备取天麻素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.1.3供试品溶液的制备取大川芎片适量，去除包衣，研碎，过40目筛，精密称取样品粉末2.0 g，置于100 mL圆底烧瓶中，加甲醇80 mL回流提取2 h，滤过，浓缩，加甲醇定容至10 mL容量瓶中，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.1.4检测波长的选择及多波长指纹图谱融合[2]光谱波长范围的选取DAD设定为200～400 nm全波长扫描。取供试品溶液，按设定的色谱条件进样测定。用所得的三维色谱-光谱数据，可知，大川芎片的色谱信号以紫外光区为主，大川芎片中的主要成分分别在210、225、254、270、320 nm下有较大吸收，故确定融合波长为210、225、254、270、320 nm。

分别从 Aglient 1100色谱工作站中导出210、225、254、270、320 nm的dif格式数据文件，使用Matlab软件编程，对dif格式数据进行全时段多波长融合，得到同时反映5个波长信息的色谱图和图谱数据，相关色谱图见图1。

2.1.5精密度试验取同一批供试品溶液(批号：20140301)，连续进样6次，记录指纹图谱并进行多波长融合，以天麻素峰为参照峰，其他各共有峰相对保留时间RSD<0.5%，相对峰面积RSD<3%，表明仪器的精密度良好，符合指纹图谱要求。

2.1.6稳定性试验取同一批供试品溶液(批号：20140301)，分别在0、2、4、8、12、18、24 h进行检测，记录指纹图谱并进行多波长融合，以天麻素峰为参照峰，其他各共有峰相对保留时间RSD<0.5%，相对峰面积RSD<3%，表明该样品稳定性良好，符合指纹图谱要求。

2.1.7重复性试验分别取同一批号(批号：20140301)样品6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液并进行检测，记录指纹图谱并进行多波长融合，以天麻素峰为参照峰，其他各共有峰相对保留时间RSD<0.5%，相对峰面积RSD<3%，表明该制备和检测方法重复性良好，符合指纹图谱要求。

2.2指纹图谱的建立、参照峰及特征峰的选择取10批大川芎片制剂，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别取10 μL，按“2.1.1”项下方法进样，记录指纹图谱并进行多波长融合，将10批大川芎片的指纹图谱数据导入中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)，选择色谱峰进行多点校正、色谱峰自动匹配后，以中位数法生成HPLC指纹图谱共有模式(图2)。结果表明10批样品的指纹图谱与共有模式的相似度分别为0.958、0.959、0.961、0.952、0.968、0.960、0.948、0.933、0.968、0.962，且相似度均>0.920。对色谱峰进行分析，选择稳定性、重复性好、特征明显的色谱峰为共有，共标定13个共有峰(图3)，共有峰面积占本文所示指纹图谱总峰面积的90%以上，符合指纹图谱共有峰的要求。其中峰S经对照品比对为天麻素色谱峰，该峰峰面积较大，重复性、稳定性较好，因此选择该峰为指纹图谱的参照峰。

2.3采用液质联用技术推断大川芎片中主要化学成分

2.3.1样品制备方法对照品制备方法见“2.1.2”项下。供试品制备方法见“2.1.3”项下。

2.3.2分析方法

2.3.2.1液相条件的选择见“2.1.1”项下色谱条件。

图1　大川芎片及天麻素对照品融合前后指纹图谱 大川芎片：A.210 nm;B.225 nm;C.254 nm;D.270 nm;E.320 nm；F.大川芎片多波长融合指纹图谱；G.多波长融合天麻素对照品图谱

图2　10批大川芎片的多波长融合指纹图谱共有模式图

图3　大川芎片融合指纹图谱

2.3.2.2质谱条件的选择电喷雾离子源(Dual ESI)，正、负离子模式检测，干燥气体流速为10 L·min-1，干燥气体温度为350 ℃，毛细管电压(Vcap)为3 500 V，雾化器压力为50 psig，碎裂电压为110 V，Skimmer 为65 V，OCT IRF Vpp为250 V，m/z范围为50~2 000。

2.3.3结果取大川芎片供试品溶液按“2.3.2”项下分析方法进行液质联用分析，应用HPLC-MS联用技术，并参考相关文献和对照品比对，对大川芎片融合指纹图谱中共有峰初步定性。通过质谱指认和对照品比对，共初步鉴定了8个共有峰，结果见表1[3~8]。

表1　大川芎片主要化学成分HPLC-MS数据及化合物推测

3讨论

大川芎片质量标准中的指标性成分为天麻素，而其来源于大川芎片中天麻药材，天麻为名贵中药材，为避免市场鱼目混珠，故建立多波长融合指纹图谱并对其主成分初步定性分析，建立全面的质量控制体系来控制样品质量，解决实际生产

问题，从而降低检测限、克服单一波长下信息量不足的缺点。

本实验考察水、70%甲醇、甲醇不同溶剂对样品的提取，结果表明不同提取溶媒对样品成分存在较大差异，大川芎片中天麻、川芎两味药材水溶性极性大的成分较多，其中水、70%甲醇提取样品色谱峰杂，分离度不好，故采用纯甲醇进行提取。大川芎片制剂中强极性成分较多并且在低波长225 nm下吸收较为明显，故选择乙腈-水系统初始梯度为98%水相分离效果较好，基线较为平稳。

本文通过多波长融合技术手段及HPLC-MS分析方法建立了大川芎片全析指纹图谱，与传统的仅以一种化学成分为参照峰作相对定量的指纹图谱相比，该法更能真实客观的反映大川芎片的内在质量，它使得指纹图谱中获得的峰得到辨认，是一种潜移默化的从相对定量到绝对定量的提升，为以后大川芎片及中成药的质量控制和物质基础研究提供新的参考依据。

参考文献：

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