解毒止泻结肠缓释微丸释放度的方法学研究

·制剂研究·

解毒止泻结肠缓释微丸释放度的方法学研究

武小赟，马静，王俊涛，夏成夫，赵小鹏

(百花医药集团股份有限公司，贵州 遵义 563000)

摘要：目的建立解毒止泻结肠缓释微丸释放度的检查方法并进行方法学验证。方法采用高效液相色谱法测定制剂中槲皮素的含量，参照《中国药典》2010年版的规定研究本制剂的释放度检查方法并进行方法学验证。结果依次在人工胃液、人工肠液、人工结肠液中对微丸进行释放度考察，人工胃液2 h不释放，人工肠液3 h内释放在15%以内，人工结肠液5 h释放完全。结论该法简单、灵敏、准确，可有效监控本品的质量。

关键词：微丸；结肠定位；释放度

基金项目：贵州省中药现代化科技产业研究开发专项(No.S2012ZP00503644369)

作者简介：武小赟，女，研究方向：中药化学及中药制剂，E-mail：wuxiaoyunbingxue@163.com

中图分类号：R944.9文献标识码：A

Study on the dissolution of Jiedu Zhixie Colon-targeted Sustained-release Pellets

WUXiao-yun,MAJing,WANGJun-tao,XIACheng-fu,ZHAOXiao-peng

(BaihuaMedicalPharmaceuticalGroupCo.,Ltd.,Zunyi563000,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a method for the dissolution of Jiedu Zhixie Colon-targeted Sustained-release Pellets,and prove that the method is reliable and durable.Methods The content of quercetin was determined by HPLC,the dissolution test of pellets was researched and avalidated according to requirement in China Phannacopeia 2010 Edition.Results The release in vitro was studied in the artificial gastric fluid,artificial intestinal fluid and artificial colon fluid in sequence.Quercetin was not released in artificial gastric fluid,less than 15% in artificial intestinal fluid,slowly in artificial colon fluid and completely at 5 h.Conclusion This method was simple,sensitive and accurate.It can be used for the quality control of pellets.

Key words:Pellet；Colon-targeted；Release

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)属于炎症性肠病的一种，是消化内科常见病。多为直肠和结肠的慢性非特异性炎症性病变，多呈反复发作的慢性过程，其发病机制尚不明确，治疗难度大。当前临床治疗手段繁多，有肠内营养、西药和中药药物治疗、手术治疗、生物靶向治疗、干细胞移植等疗法[1]。解毒止泻结肠缓释微丸由单一苗药对坐叶组成，对坐叶为茜草科植物对坐叶HedyotisuncinellaHook.et Arn．的干燥全草，夏、秋二季采收，具有清热解毒、调中止泻之功效，用于治疗腹泻、腹胀、腹痛、里急后重以及痢疾、急慢性胃肠炎等证[2]。该味药材在治疗胃肠道疾病方面具有独到疗效。将其开发制成结肠缓释制剂，使药物主要在结肠定位缓慢释放，提高结肠病变部位的药物浓度，发挥治疗结肠炎的最佳疗效，为中药新型结肠靶向给药系统的研究积累实验基础。本文对解毒止泻结肠缓释微丸的释放度的检查方法进行研究，以期达到全面控制药品质量的目的。

1仪器与材料

1.1仪器BY300A小型包衣锅(上海黄海药检仪器厂)；ZRS-8G智能溶出实验仪(天津市新天光分析仪器技术有限公司)；岛津液相色谱仪(包括LC-15C泵、SPD-15C紫外检测器、SIL-10AF自动进样器)；Diamonsil色谱柱(C18，4.6 mm×250 mm,5 μm)；AUY-220型电子天平(万分之一，日本岛津公司)；AB135-S型电子天平(十万分之一，日本岛津公司)；KQ-40ODB型数控超声清洗波器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2材料对坐叶药材：由公司采供部提供，经检验符合《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003版的规定；Eudragit S100、Eudragit L100(德国罗姆公司)；羧甲基纤维素钠(上海卡乐康公司);柠檬酸三乙酯(TEC，德国罗姆公司);滑石粉(北京燕京制药);乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100081-200907)。

2实验方法与结果

2.1溶液及微丸的制备

2.1.1解毒止泻结肠缓释微丸的制备取部分对坐叶药材，粉碎成细粉并过100目筛，备用。剩余药材加水煎煮三次，第一次2 h，第二、三次各1 h，合并煎液，滤过。滤液浓缩至适量，加乙醇使含醇量为60%，搅匀，静置24 h，滤过。滤液浓缩至稠膏，减压干燥至干。将干膏粉粉碎过100目筛，与上述细粉合并，然后与羧甲基淀粉钠以8∶1(w/w)的比例混合均匀，过100目筛三次，用95%的乙醇为润湿剂滚动凝聚成1 mm左右的微丸，60 ℃干燥5 h。再用浓度为6%的Eudragit L100∶Eudragit S100(1∶2)的包衣液包衣，包衣液中加入增塑剂柠檬酸三酯和抗粘剂滑石粉，增重6%，制得结肠缓释微丸[3~6]。

2.1.2溶液的制备

0.2 mol·L-1磷酸二氢钾溶液：取27.22 g磷酸二氢钾，用水溶解并稀释至1 000 mL。

0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液：取8 g氢氧化钠，用水溶解并稀释至1 000 mL。

人工胃液：取稀盐酸7.65 mL，加水稀释成1 000 mL，即得。

人工肠液：取上述250 mL的0.2 mol·L-1磷酸二氢钾溶液与112 mL的0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液混合后，再加水稀释至1 000 mL，摇匀，即得。

人工结肠液：取上述250 mL的0.2 mol·L-1磷酸二氢钾溶液与222.5 mL的0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液混合后，再加水稀释至1 000 mL，摇匀，即得。

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品适量，加溶出介质制成每1 mL含槲皮素5 μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取溶出液直接测定。

2.2释放度检查方法采用《中国药典》2010年版(二部)附录Ⅹ C项下的溶出度测定第三法(小杯法)[7]，评估药丸的体外释药性能。以槲皮素含量为指标，释放介质依次为含0.5%吐温-80的人工胃液(pH 1.2的盐酸溶液)、人工肠液(pH 6.8的磷酸二氢钾溶液)、人工结肠液(pH 7.8的磷酸二氢钾溶液)，溶质体积为200 mL，转速为50 rpm，体系温度控制在(37±0.5)℃，取样时间为人工胃液2 h、人工肠液3 h、人工结肠液5 h(n=6)。用0.45 μm的滤膜过滤，取样20 μL，测定。

2.3指标成分槲皮素的含量测定方法色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶液(53∶47)为流动相；检测波长为370 nm；理论板数以槲皮素计算应不低于4 000。对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.4微丸释放度检查的方法学验证

2.4.1溶出介质的考察取微丸1.2 g，精密称定，共六份，分别置200 mL的人工胃液、人工肠液、人工结肠液及含0.5%的吐温-80的前述种介质中，测定胃液2 h、肠液3 h、结肠液5 h，槲皮素在含和不含0.5%的吐温-80的3种介质中的溶出度。结果，两种人工胃液中均检测不到槲皮素；不加表明活性剂的肠液中亦检测不出槲皮素，加表明活性剂的肠液中槲皮素的含量为11.28%；不加表面活性剂的结肠液中槲皮素含量为46.74%，加表面活性剂的结肠液中槲皮素中含量为95.23%。所以选择含0.5%的吐温-80的人工胃液、人工肠液、人工结肠液作为释放度的溶出介质。

2.4.2漏槽实验分别于180、200、250 mL的人工结肠液(含0.5%的吐温-80)中投入3.6 g微丸，超声处理30 min，测定含量，结果3种体积的介质中槲皮素溶出的百分含量分别为78.52%、96.45%、95.78%，故选择200 mL的溶出介质即可使槲皮素释放完全。

2.4.3标准曲线的考察取槲皮素对照品(含量：96.5%)4 mg，精密称定，置50 mL的容量瓶中，用人工结肠液(含0.5%的吐温-80)溶解并稀释至刻度，然后从中精密移取10 mL,置100 mL的容量瓶中，用溶出介质定容至刻度，得到槲皮素对照品储备液。精密移取对照品储备液适量，稀释制备得到4、2、1、0.5 μg·mL-1的溶液；取上述5种浓度的对照液注入高效液相色谱仪，测定槲皮素的峰面积积分值，以槲皮素浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程：Y=85 393X-9 159.3，R2=0.999 8。说明槲皮素浓度在0.5~8 μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.4.4精密度实验称取适量的槲皮素对照品，用人工结肠液配制成高、低两个浓度，分别为4.2 μg·mL-1和0.42 μg·mL-1，重复进样6次，测定峰面积积分值，结果RSD分别为0.27%、0.92%。表明该检测方法在高低两个浓度下，精密度均良好。

2.4.5回收率实验采用加样回收法测定回收率。精密称取6份已测定含量的肠溶微丸(槲皮素含量为702.15 μg·g-1)0.6 g于溶出杯中，各加入200 mL的人工结肠液(含0.5%的吐温-80)，事先配制结肠液时加入适量的槲皮素对照品，使其槲皮素的浓度为2.13 μg·mL-1，照肠溶微丸溶出度的测定方法进行测定，5 h后取溶出液，过0.45 μm的滤膜，测定。计算回收率，结果见表1。

表1　加样回收试验结果表

2.4.6稳定性试验取解毒止泻结肠缓释微丸1.2 g，置200 mL的人工结肠液(含0.5%的吐温-80)中，照肠溶微丸的溶出度测定方法进行检测，5 h后取溶出液，分别于0、2、4、6、8 h各进样1次，测定槲皮素的峰面积，分别为283 713、286 022、281 172、281 783、284 462，RSD为0.70%。说明样品在溶出介质中8 h内稳定性较好。

2.4.7滤膜的吸附性考察精密称取槲皮素对照品适量，用人工结肠液(含0.5%的吐温-80)制备成浓度为4.2 μg·mL-1的对照品溶液，共3份，测定峰面积，然后用0.45 μm的有机滤膜过滤，同法测定。结果显示：槲皮素过膜与未过膜峰面积的比值为0.997，RSD为0.28%，表明有机滤膜对槲皮素无明显吸附，可忽略不计。

2.4.8均一性试验取解毒止泻结肠缓释微丸1.2 g，照肠溶微丸的溶出度测定方法进行测定，于2、3、4、5、6 h取溶出液过0.45 μm的滤膜，进行测定，并及时补充相同温度的介质。测定不同时间的溶出量，绘制溶出曲线，结果表明，本法溶出均一性良好(见表2)。

2.5样品释放度的测定取3批解毒止泻结肠缓

释微丸的中试样品，按照“2.2”和“2.3”项下的方法进行释放度的测定。结果3批产品释放差异较小，符合规定。

表2　溶出均一性考察

3讨论

3.1解毒止泻结肠缓释微丸是利用pH依赖性的包衣材料Eudragit包单层衣，并利用单层衣的厚度，使其具有综合时滞效应，在结肠定位缓慢释放。该方法是目前普遍认可的方法，具有受胃肠道环境影响较小，结肠定位性好等优点。

3.2结肠定位制剂要求在胃中不释放，在肠液释放不超过20%，主要是在结肠中释放。所以在做释放度的方法学考察时，均以人工结肠液为介质进行验证。另外，因为微丸在结肠中是缓慢释放，所以对低浓度和高浓度的溶出液分别进行精密度考察，以确保整个释放过程中，含量都能精确测定。

3.3本研究中所制备的解毒止泻结肠缓释微丸，经体外试验表明，可以达到结肠定位给药的要求。但尚需进行进一步的体内研究，以充分表征其结肠定位释放的特点。

参考文献：

[1]王庆谚,王希利.溃疡性结肠炎治疗进展[J].辽宁中医药大学学报，2013,15(5):237-239.

[2]贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[S].贵阳:贵州科技出版社,2003:149.

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[4]李珂.肠康宁口服结肠定位制剂的药学研究[D].成都:成都中医药大学,2009.

[5]刘乐洋.护肠清毒结肠定位控释微丸的研制[D].济南:山东中医药大学,2012.

[6]王晓辉.立克宁肠溶微丸的制备工艺及质量标准的初步研究[D].哈尔滨:黑龙江中医药大学,2006.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(二部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:附录87.