丹参酮ⅡA磺酸钠联合阿托伐他汀对冠心病患者TLR4炎症信号通路及免疫相关指标的影响

·论著·

丹参酮ⅡA磺酸钠联合阿托伐他汀对冠心病患者TLR4炎症信号通路及免疫相关指标的影响

徐涛张哲王锦鹏田丰永刘欣

项目来源：河北省中医药管理局课题(编号：2015031)

作者单位： 075000河北省张家口市，河北北方学院附属第一医院(徐涛)；河北省人民医院老年医学重点实验室(张哲)，功能科(刘欣)；河北省沧县医院(王锦鹏、田丰永)

E-mail：13582029996@163.com

【摘要】目的观察丹参酮ⅡA磺酸钠联合阿托伐他汀对冠心病患者TLR4炎症信号通路及免疫相关指标的影响，以TLR4炎症信号通路为靶点探讨丹参酮ⅡA磺酸钠治疗冠心病的可能机制。方法选取2014年1月至2015年1月诊治的冠心病患者160例，随机分为对照组和观察组，每组80例。对照组在常规治疗基础上给予阿托伐他汀治疗，观察组在对照组基础上加用丹参酮ⅡA磺酸钠注射液，疗程为30 d。采用Real time-PCR测定外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清白介素-6(IL-6)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属白酶-9(MMP-9)及抗氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)抗体水平。流式细胞仪测定外周血淋巴细胞亚群指标)变化。免疫比浊法测定免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)及补体C3、C4水平。结果与治疗前比较，治疗后2组TLR4 mRNA、IL-6、hs-CRP、TNF-α、MMP-9、ox-LDL、IgA、IgG、IgM、C3、C4水平显著降低水平显著升高(P<0.05)，但观察组上述指标改善程度优于对照组(P<0.05)。结论丹参酮ⅡA磺酸钠联合阿托伐他汀能抑制外周血TLR4 mRNA炎症信号通路的激活，并改善机体免疫功能紊乱，这可能是丹参酮ⅡA磺酸钠发挥治疗作用的机制之一。

【关键词】丹参酮ⅡA磺酸钠；阿托伐他汀；冠心病；Toll样受体4；免疫功能

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.22.001

通讯作者：刘欣，050051石家庄市，河北省人民医院功能科；

【中图分类号】R 541.4【文献标识码】A

收稿日期：(2015-04-29)

Effect of sodium tanshinone ⅡA sulfonate combined with atorvastatin on TLR4 inflammatory signal pathway and immune function of patients with coronary heart diseasesXUTao*,ZHANGZhe,WANGJinpeng,etal.*TheFirstHospitalofNorthCollege,Hebei,Zhangjiakou050051,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of sodium tanshinone ⅡA sulfonate combined with atorvastatin on TLR4 inflammatory signal pathway and immune function of patients with coronary heart diseases (CHD) in order to explore the possible action mechanism of sodium tanshinone ⅡA sulfonate in treatment of CHD.MethodsOne hundred and sixty patients with coronary artery diseases who were admitted into our hospital from January 2014 to January 2015 were randomly divided into observation group (n=80) and control group (n=80). The patients in control group were treated with atorvastatin,on the basis of symptomatic treatment,however, the other patients in observation group, on the basis of the control group, were treated with sodium tanshinone ⅡA sulfonate,with a treatment course of 30 days for both groups. The expression levels of TLR4 mRNA in peripheral blood were detected by Real time-PCR. The serum levels of IL-6, hs-CRP, TNF-α, MMP-9 and ox-LDL were measured by ELISA.by ELISA．The lymphocyte subsets) were detected by flow cytometry. The immunoglobulins (IgA, IgG, IgM) and complement levels (C3,C4) were examined by turbidimetric inhibition immuno assay for both groups.Results As compared with those before treatment，the levels of TLR4 mRNA，IL-6，hs-CRP，TNF-α，MMP-9，ox-LDL，IgA，IgG，IgM，C3，C4 were significantly decreased after treatment for both groups (P<0.05)，however，the levels of were significantly increased (P<0.05),moreover,the observation group was superior to control group in the improvement degree of these indexes (P<0.05).ConclusionSodium tanshinone ⅡA sulfonate combined with atorvastatin can significantly inhibit the activation of TLR4 inflammatory signal transduction pathway and can improve immunological function disorders,which may be one of the action mechanisms of sodium tanshinone ⅡA sulfonate in treatment of CHD.

【Key words】sodium tanshinone ⅡA sulfonate; atorvastatin; coronary artery diseases; TLR4;immune function

冠心病是严重危害中老年人群健康的心血管疾病之一，其病理机制是在冠状动脉粥样硬化基础上局部血栓形成造成冠脉血流下降，最终导致心肌缺血和实质性损伤[1]。研究显示，细胞免疫、体液免疫、补体系统及细胞因子均与炎性反应密切相关，这一过程贯穿动脉粥样硬化发生发展的始末。因此，免疫炎症损伤是动脉粥样硬化的主要病理机制之一[2，3]。本研究以TLR4炎症信号通路为切入点，通过观察丹参酮ⅡA磺酸钠联合阿托伐他汀对冠心病患者免疫炎性反应相关指标的影响，旨在探讨丹参酮ⅡA磺酸钠治疗冠心病的可能机制，为丹参酮ⅡA磺酸钠在冠心病治疗领域的应用提供实验依据。

1资料与方法

1.1一般资料选取2014年1月至2015年1月河北省人民医院心内科收治的冠心病患者160例。所有患者均经临床症状、冠脉造影、心电图检查确诊为冠心病。160例患者随机分为对照组和观察组，每组80例。2组年龄、性别比、病程等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　2组一般资料比较　n=80

1.2纳入及排除标准(1)纳入标准：①符合中华医学会心血管病学分会制定的《冠心病诊治指南(2011版)》；②患者签署知情同意书；③经皮冠脉支架形成术治疗效果良好者。(2)排除标准：①恶性肿瘤患者；②严重心、肝、肺、肾等重要脏器功能不全者；③血液系统、免疫系统疾病患者；④经皮冠脉支架治疗失败者；⑤有他汀类药物过敏史者；⑥有精神疾病病史者。

1.3治疗方法2组均给予吸氧、硝酸酯类、钙拮抗剂、β受体阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂、阿司匹林等常规治疗，并给予低脂饮食。对照组给予口服阿托伐他汀片(石家庄以岭药业股份有限公司)，10 mg/d，1次/d。观察组在对照组基础上给予丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(石家庄以岭药业股份有限公司)，80 mg加入到250 ml 5%葡萄糖注射液中，静脉滴注，1次/d。疗程均为30 d。

1.5检测方法

1.5.1Real time-PCR:根据GeneBank中人TLR4 mRNA序列，采用DNAMAN软件设计引物，引物序列见表2，由日本Takara生物技术有限公司合成。Trizol提取外周血单个核细胞总RNA，紫外分光光度计定量RNA的纯度和浓度，使用反转录试剂盒合成cDNA第1链。PCR反应在ABI 7300型荧光定量PCR仪上进行，扩增完毕后进入仪器自带的SDS v1.3软件结果分析界面，使用SPSS10.0统计软件分析得到各样本、各基因扩增的Ct值。设对照组样品为标准1，目的基因mRNA相对表达水平为2-△△Ct，设β-actin为内参照基因。见表2。

表2　TLR4引物序列及扩增产物长度

1.5.2ELISA法:采用ELISA法测定血清IL-6、IL-8、hs-CRP、TNF-α及ox-LDL抗体水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。严格按照试剂盒说明书操作。960酶标仪购自美国Sigma公司。

1.5.4免疫比浊法:在全自动生化分析仪上采用免疫透射比浊法测定IgA、IgG、IgM、C3、C4水平。7080全自动生化分析仪购自日本日立公司。

2结果

2.12组外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达比较治疗前2组外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后2组TLR4 mRNA表达均较治疗前有不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但观察组降低程度更明显，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.22组血清炎性因子水平比较治疗前2组血清IL-6、hs-CRP、TNF-α、MMP-9水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后2组IL-6、hs-CRP、TNF-α、MMP-9水平均较治疗前有不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但观察组降低程度更明显，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表32组外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达比较

组别TLR4mRNA相对表达水平对照组 治疗前4.8±0.8 治疗后3.5±0.5*观察组 治疗前4.9±0.8 治疗后2.3±0.4*#

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

表4　2组血清炎性因子水平比较　 ±s

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

表52组T淋巴细胞亚群比较

组别CD+3(%)CD+4(%)CD+8(%)CD+4/CD+8对照组 治疗前49±8 24±3 12.6±2.01.68±0.22 治疗后59±9*33±5*18.3±2.9*1.79±0.26*观察组 治疗前49±8 24±3 13.0±2.11.70±0.23 治疗后72±9*#44±6*#23.4±3.2*#1.90±0.35*#

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

2.42组免疫球蛋白、补体比较治疗前2组IgA、IgG、IgM、C3、C4比较，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后2组IgA、IgG、IgM、C3、C4均较治疗前有不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但观察组降低程度更明显，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表62组免疫球蛋白、补体比较

组别IgAIgGIgMC3C4对照组 治疗前3.79±0.51 14.0±2.1 2.77±0.42 2.45±0.32 0.47±0.07 治疗后2.82±0.42*11.2±1.8*2.01±0.26*1.32±0.23*0.34±0.04*观察组 治疗前3.82±0.56 13.9±2.0 2.80±0.43 2.49±0.35 0.48±0.06 治疗后1.93±0.24*#7.5±1.1*#1.34±0.18*#0.73±0.12*#0.19±0.03*#

注：与治疗前比较,*P<0.05;与对照组比较,#P<0.05

2.52组抗ox-LDL抗体水平比较治疗前2组抗ox-LDL抗体水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后两组抗ox-LDL抗体水平均较治疗前有不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但观察组降低程度更明显，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表7。

表72组抗ox-LDL抗体水平比较

组别抗ox-LDL抗体对照组 治疗前174±24 治疗后142±20*观察组 治疗前180±26 治疗后98±14*#

注：与治疗前比较,*P<0.05;与对照组比较,#P<0.05

3讨论

冠心病是好发于中老年人的常见心血管疾病之一，具有发病率和病死率高、易反复发作的特点，若未采取及时有效的干预措施病情呈持续进展，易导致心肌缺血坏死、心力衰竭，甚至猝死[4]。目前，临床治疗冠心病主要采取增加冠脉流量、抗凝、抑制血栓形成等治疗措施，但疗效不甚理想。因此，阐明冠心病的发病机制对于疾病治疗具有重要的指导价值。

越来越多的研究发现，免疫炎性反应贯穿动脉粥样硬化发生发展的始末，并且炎性因子可作为冠心病发生的独立危险因素。近年来，TLR4介导的免疫炎性反应在动脉粥样硬化形成及冠心病发生发展中的作用日益受到重视。TLR4是脂质代谢紊乱、免疫炎性反应、氧化应激等多个病理过程中的桥梁，激活TLR4可通过多条信号级联反应导致NF-κB激活和核转位，从而上调hs-CRP、TNF-α等炎性因子的转录和表达，诱发慢性炎性反应[5]。IL-6是炎性反应中起核心作用的重要介质，具有诱导血管活性物质释放、促进凝血及血栓形成等多重生物学功能[6]。hs-CRP是反应机体炎症状态的敏感指标，可作为判断斑块稳定性、疾病严重程度及预后的预测因子[7]。TNF-α由单核细胞、巨噬细胞产生，具有损伤血管内皮细胞及促进凝血、血栓形成等作用，最终导致动脉粥样硬化发生发展[8]。MMP-9是MMPs家族的重要成员，通过降解细胞外基质导致斑块不稳定性增高甚至破裂[9]。本研究结果显示，观察组治疗后TLR4 mRNA、IL-6、hs-CRP、TNF-α、MMP-9水平显著低于对照组(P<0.05)，提示丹参酮ⅡA磺酸钠联合阿托伐他汀能进一步发挥抗炎作用，且这一作用与TLR4炎症信号通路的抑制有关，与前人研究结果[10]一致。

综上所述，丹参酮ⅡA磺酸钠联合阿托伐他汀能够显著抑制TLR4炎症信号通路的激活及炎性因子的分泌和释放，并改善机体免疫功能紊乱，这可能是丹参酮ⅡA磺酸钠发挥抗炎作用的机制之一。

参考文献

1薛娟.冠心病的治疗与预防.中国实用医药，2014，9：255-256.

2Hansson GK, Hermansson A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology,2011,12: 204-212.

3Libby P, Okamoto Y, Rocha VZ, et al. Inflammation and atherosclerosis. Circ J,2010,74: 213-220.

4刘士福. 双联抗血小板长期治疗老年冠心病疗效观察. 现代中西医结合杂志，2014，23：736-737.

5Adam E, Mullick Peter S, Tobias Linda K, et al. Toll-like receptors and atherosclerosis. Immun Res, 2006, 34: 193-209.

6李峰梅，龙训.中药联合阿托伐他汀对冠状动脉临界病变冠心病患者预后及血脂、炎症反应的影响. 中国实验方剂学杂志，2013，19：305-308.

7Abhashi SA, Kryeziu FU, Nazreku FD. Increased carotid intima-media thickness associated with high hsCRP levels is a pridictor of unstable coronory artery disease. Cardiovas J Afr,2013,24: 270-273.

8温晓宏，郑毅，陈珊珊，等.肿瘤坏死因子-α拮抗剂对强直性脊柱炎患者血清25-羟基维生素D的影响. 中国临床医生，2014，42: 34-36.

9Wang L, Lü S, Zhang W, et al. Comparison of high sensitivity C-reactive protein and matrix metalloproteinase 9 in patients with unstable angina between with and without significant coronary artery plaques. Chin Med J (Engl),2011,124: 1657-1661.

10齐艳艳，史永照. 丹参对缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究进展. 上海中医药大学学报，2010，24: 89-91.

11Moore KJ,Freeman M．Targeting innate immunity for CV benefit． Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies，2008，5: 15-23．

·消息·

杂志稿件内容的有关规范要求

1.当报告以人为研究对象的试验时，作者应该说明其遵循的程度是否符合负责人体试验的委员会(单位性的、地区性的或国家性的)所制定的伦理学标准并得到该委员会的批准，是否取得受试对象的知情同意。

2.根据GB/T 7408-94《数据元和交换格式信息交换日期和时间表示法》，由特定起点与终点定界的时间段的表示，起点与终点之间以一字线为分隔符，而不再用波纹线。示例如下：2001—2004年，而不再表示为2001～2004年，但“—”也可以用“至”取代。注意：除了上述时间段之外的其他计数、计量范围的表示，仍然用“～”，如2～8 kg。

3.根据人民卫生出版社出版的全国高等学校教材《卫生统计学》第5版，报告统计学检验的结论时，对P值小于或等于检验标准(一般为0.05)的情况，一律描述为“差异有统计学意义”，同时写明P值的具体数值或相应的不等式，不再采用将P<0.05描述为“差异有显著意义(或差异有显著性)”、将P<0.01描述为“差异有非常显著意义(或差异有非常显著性)”的表达方法。在用不等式表示P值的情况下，一般选用P>0.05、P<0.05和P<0.01三种表达方式即可满足需要，无须再细分为P<0.001或P<0.0001。

4.为便于表格的排版和版式的美观，表格中注释用的角码符号一律采用单个角码的形式，按下列顺序选用：*、#、△、☆、▲、★；在表注中依先纵后横的顺序依次标出。

本刊编辑部