连翘、黄连、穿心莲对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响

葛 婧，郭永军，王庆奎，徐大为，孙学亮，陈成勋，邢克智

（天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）

连翘、黄连、穿心莲对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响

葛 婧，郭永军通信作者，王庆奎，徐大为，孙学亮，陈成勋，邢克智

（天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）

为了解连翘、黄连、穿心莲对半滑舌鳎血液抗氧化能力的影响。本文采用单因子试验设计，将连翘、黄连、穿心莲按0、5、10、15 g/kg添加到饲料中，7，14，21 d后取样，检测半滑舌鳎血液总超氧化物歧化酶（T-SOD），过氧化氢酶（CAT），总抗氧化能力（T-AOC），丙二醛（MDA），总胆固醇（T-CHO），甘油三酯（TG）等指标。结果表明，连翘组：14 d后，5 g/kg组T-SOD活力达到最高。21 d后，5 g/kg组CAT活力最高。14 d后15 g/kg组MDA值显著低于对照组。黄连组：14 d后15 g/kg组T-SOD活力达到最高。21 d后，15 g/kg组T-AOC活力显著高于对照组。穿心莲组：14 d后，10 g/kg组T-SOD活力，CAT活力及T-AOC活力都达到最高。21 d后，5g/kg组MDA值显著低于对照组。10 g/kg组T-CHO值和TG值在7 d后均显著高于对照组。结果显示，连翘、黄连及穿心莲单独添加对半滑舌鳎血液抗氧化指标均有不同程度的影响。

连翘；黄连；穿心莲；半滑舌鳎；抗氧化指标

近年来，随着水产养殖业的发展，化学药物的滥用，导致养殖水域环境恶化，水产动物疾病频发[1]。水产动物在应激和疾病时，抗氧化能力下降，体内自由基的产生和消除失衡，机体出现氧化性损伤[2]。半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）属鲽形目（Pleuronectiformes）、舌鳎科（Cynoglossidae）、舌鳎属（Cynoglossus），是我国北方常见的底栖鱼类，属暖温性，自然分布区集中于我国的黄、渤海海域[3]。其肉味鲜美，经济价值很高。近年来，半滑舌鳎作为重要的养殖水产品种，具有较高的经济效益，且发展潜力很大。研究表明，半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）在高密度（8.20 kg/m2）养殖条件下，其肝胰脏超氧化物歧化酶（SOD）活力显著低于中（4.83 kg/m2）、低（2.32 kg/m2）密度养殖条件[4]。半滑舌鳎经受 3 h急性拥挤（14 kg/m2）胁迫后，血液过氧化氢酶（CAT）活力显著降低[5]。牙鲆幼鱼（Paralichthys olivaceus）养殖1 d 时，随着温度的升高其肝脏过氧化氢酶（CAT）和超氧化物岐化酶（SOD）活力逐渐升高[6]。因此，抗氧化剂在保护水产动物不受自由基引起的氧化损伤、增强抗病力方面有着重要的作用。

中草药作为一种无抗药性，低毒性的天然药物，在水产养殖中广泛应用，不仅能促进水产动物的生长，还能增强其抗氧化性能[7-8]。中草药植物体内具有防御、清理和恢复过量自由基的体制，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等抗氧化酶是其重要组成[9]，另一方面，如多酚、黄酮、多糖类化合物等抗氧化酶活性增强剂，可调节和增强机体抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT等）活性[10]。研究报道，饵料中添加3％的大黄，可使得鲤鱼免疫器官增重，溶菌活性增强，吞噬细胞吞噬能力加强[11]；半滑舌鳎饲料中添加黄芩能显著增强半滑舌鳎的吞噬活性及，溶菌酶活性[12]；鲤鱼饲料中添加2％的野菊花可显著增强鱼体血液吞噬细胞的吞噬能力以及溶菌酶活力，且鱼体头肾的重量显著增高[13]。因此，中草药作为天然且环保型的饲料添加剂在水产养殖中的应用越来越常见。

连翘是木犀科连翘属落叶灌木植物，常以果实入药，具有清热解毒、消肿散结之功效[14]，历来被视为疮家要药[15]。黄连为毛茛科植物，根茎入药，性寒，味苦，有清热解毒、泻火等功效[16]。穿心莲为爵床科穿心莲属植物穿心莲的干燥地上部分，性寒，味苦，具有清热解毒、消肿止痛等功效。基于此，本文将连翘（Forsythia suspense），黄连（Coptidis rhizoma），穿心莲（Andrographis paniculata）按不同剂量分别添加到饲料中喂食半滑舌鳎，研究其对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响，为连翘，黄连，穿心莲在半滑舌鳎健康养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料的处理

半滑舌鳎取自天津市海发珍品实业发展有限公司养成车间，健康状况良好，体重（95.45± 5.29）g。试验前将半滑舌鳎放在方形聚乙烯箱（78 cm×58 cm×46 cm）中暂养7 d，养殖水温为（21±1）℃，盐度为（20±1）‰，pH为（8±0.5），NH4＋-N为（0.026±0.003）mg/L，NO2－-N为（0.028±0.001）mg/L，DO为（8±1）mg/L，自然光照。每日8:00和16:00饲喂，每次投料量为鱼体重1％，30 min后吸除残饵并换水1/3，试验开始前1天停食。

连翘、黄连及穿心莲原药（购自天津市药材公司）按比例称量，温水浸泡50 min，砂锅3次煎煮（加入20倍量水，汤药微微沸腾前用武火，沸腾后改用文火，一煎40 min，二煎35 min，三煎30 min，连续煎煮）后滤除药渣，汤剂全部添加到半滑舌鳎基础饵料中。基础饵料（表1）以鱼粉、鱼油、食用淀粉等为原料制成。

表1 饵料配方组成和营养组成 ％

1.2 试验设计

连翘、黄连及穿心莲分别按0、5、10、15 g/kg的添加量（添加的汤剂量为相当于g/kg中草药熬制出来的，文中后面以g/kg中草药表示汤剂的添加量），配制成等氮等能饲料。饲养周期21 d，每个水平3个重复，每箱20尾。驯化7 d后投喂试验饵料，分别于投喂试验饵料的7、14、21 d后取样。

1.3 样品采集，处理和测定

在投喂试验饵料的7、14、21 d后，试验鱼停食24 h后取样，MS-222麻醉（100 mg /L），每箱随机取6尾鱼，2 mL无菌注射器尾柄采血，肝素钠（50 U/mL）抗凝，4 ℃下5 000 r/min离心10 min，取上清，-80 ℃保存备用。应用试剂盒（南京建成生物工程研究）测定血液中总超氧化物歧化酶（T-SOD），过氧化氢酶（CAT），总抗氧化能力（T-AOC），丙二醛（MDA），总胆固醇（T-CHO），甘油三酯（TG）的活力。

1.3.1 总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力测定

采用羟胺法，用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。单位定义：每mL反应液中SOD的抑制率达50％时所对应的SOD量为一个酶活力单位。血清SOD活力（U/mL）＝（OD对照－OD测定）/OD对照÷50％×稀释倍数。

1.3.2 丙二醛（MDA）含量测定

采用硫代巴比妥酸（TBA）法，用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。计算公式：血清中 MDA 含量（nmol/mL）＝（OD测定-OD空白）/（OD标准-OD空白）×标准品浓度（10 nmol/mL）/样本测试前稀释倍数。

1.3.3 过氧化氢酶（CAT）活力测定

采用可见光法，用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。单位定义：以每mL血清每秒钟分解1 μmol的H2O2的量为一个酶活力单位。计算公式：血清CAT活力（U/mL）＝（OD对照－OD测定）×271×1/60/取样量×样本测试前稀释倍数。

1.3.4 总抗氧化（T-AOC）能力测定

用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。单位定义：在37 ℃时，以每分钟每毫升血清（血浆）使反应体系的吸光度（OD）值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。计算公式：血清CAT活力（U/mL）＝（OD测定－OD对照）/0.01/30×反应液总量/取样量×样本测试前稀释倍数。

1.3.5 总胆固醇（CHO）含量测定

采用COD-PAP法，用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

1.3.6 甘油三酯（TG）含量测定

采用GPO-PAP酶法，用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

1.4 数据分析

采用SPSS18.0软件对数据作单因素方差分析（One-Way ANOVA），LSD和Duncan法比较数据间差异显著性，P＜0.05为差异显著。统计值均用平均值±标准差（Mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 连翘对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响

饲料中添加不同含量的连翘对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响见表2。在14 d后，5 g/kg组T-SOD活力达到最高值。在21 d后，各组CAT活力均达到最高值，且在5 g/kg组CAT活力最高。在7 d，14 d后，各组T-AOC活力均低于对照组，但在21 d后均高于对照组。不同含量组MDA值在14 d，21 d后均低于对照组，且在14 d后15 g/kg组显著低于对照组。

表2 连翘对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响

续表2

2.2 黄连对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响

饲料中添加不同含量的黄连对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响见表3。在14 d后15 g/kg组T-SOD活力达到最高值。各组CAT活力在21 d后显著升高，但CAT活力均低于对照组。7 d后各组T-AOC活力均低于对照组，且在21 d后，15 g/kg组显著高于对照组。各组MDA值在21 d后，15 g/kg组显著低于对照组。不同含量组黄连对血液T-CHO值有显著影响，但各组T-CHO值均低于对照组。

表3 黄连对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响

2.3 穿心莲对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响

饲料中添加不同含量的穿心莲对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响见表4。在14 d后，10 g/kg组T-SOD活力达到最高值。仅在14 d后，各组CAT活力高于对照组，且10 g/kg组CAT活力最高。各组T-AOC活力在14 d，21 d后显著高于对照组，且10 g/kg组T-AOC活力最高。不同含量组MDA值在21 d后，5 g/kg组显著低于对照组。10 g/kg组T-CHO值和TG值在7 d后均显著高于对照组。

表4 穿心莲对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响

3 讨论

生命体在其生命活动中不断产生活跃的自由基，而自由基会对蛋白质分子、酶分子甚至整个细胞产生伤害，导致机体损伤及衰老[17]。在一定程度上，自由基的产生与机体抗氧化防护体系处于动态平衡状态。SOD可将自由基转化成过氧化氢，进而CAT 将过氧化氢还原成氧分子和水，以此来维持机体细胞内环境的平衡[18]。SOD 和 CAT活性可以准确地反映机体内自由基的代谢情况，从而有效地判断机体的抗氧化防御功能及健康情况[19]。当机体不能清除多余的自由基时，就会产生氧化压力[19-21]。多余的自由基会侵犯生物膜，生成脂质过氧化物（LPO），并最终生成丙二醛（MDA）[22]。MDA可使生物膜结构改变，细胞膜的流动性降低，导致细胞膜的脂质过氧化损伤，因此MDA含量不仅能显示机体脂质过氧化程度的高低，也能间接反映其抗氧化能力的强弱[23]。

研究表明，许多疾病的发生发展与自由基及其诱导的氧化反应有关[24-26]。中草药低毒，无抗药性，能促进水产动物生长，增强抗氧化能力[27-29]，有效清除自由基对水产动物机体的氧化损伤[30]。研究发现，中草药作为天然植物，具有防御、清除和修缮多余自由基的系统，而超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶是其重要组成部分[31]。因此寻求能有效清除水产动物体内自由基，减少疾病发生，促进生长的中草药饲料添加剂极其重要。

3.1 连翘对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响

本试验中，不同含量的连翘可显著影响半滑舌鳎血清T-SOD，CAT，T-AOC活力以及MDA含量，说明连翘可不同程度的提高半滑舌鳎血液抗氧化机能。其中7 d，14 d后，各组T-AOC活力均低于对照组，在21 d后高于对照组。而不同含量组连翘对半滑舌鳎血液T-CHO值和TG值均无显著影响。其影响原因可能是，连翘有效成分复杂，其添加方式不同对生物体影响结果不同。如研究表明，用连翘叶提取物给小鼠灌胃，可显著降低其脑组织中 MDA水平，增强脑组织中SOD活性[32]。凡纳滨对虾饲料中添加2％的黄芪，可显著增强其超氧化物歧化酶活力和血清总蛋白含量[33]；大蒜、螺旋藻、刺五加、黄芪可显著提高银鲫血清LSZ活性、SOD活力[34]。

3.2 黄连对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响

该试验中，不同含量组黄连虽显著影响半滑舌鳎血液中T-SOD，CAT，T-AOC活力以及MDA，T-CHO含量，但结果有一定偏差。各组CAT活力在21 d后虽显著升高，但均低于对照组。7 d后各组T-AOC活力也均低于对照组。不同含量组T-CHO值均低于对照组，且不同含量组黄连对血液TG值无显著影响。研究表明，不同剂量的杜仲叶添加到草鱼饲料中，能显著增强草鱼血清的非特异性免疫能力[35]；大黄、穿心莲、板蓝根和金银花能显著增强鱼类血液以及体表粘液中的溶菌酶活性[36]。

3.3 穿心莲对半滑舌鳎血液抗氧化指标的影响

研究表明，将穿心莲浸膏粉添加到罗非鱼饲料中，可显著降低其肝脏中MDA含量，并显著提高其血清中SOD活力[37]。白芍、五味子、党参、刺五加、黄芪和鱼腥草的醇提取物添加到鲫基础饲料中，可显著提高鲫鱼的免疫力，且抗病能力增强[38]；鲤饲料中添加刺五加、蒲公英、枸杞子、金银花和大蒜等，可显著增强鲤血清中和免疫器官中的溶菌酶活性[38]。该试验表明，不同含量组穿心莲在一定程度上可显著影响半滑舌鳎抗氧化指标能力，与上述研究结果一致。

4 结论

本试验结果表明，不同梯度的连翘，黄连，穿心莲均能不同程度的提高半滑舌鳎的血液抗氧化能力。但连翘，黄连，穿心莲的最适宜添加量以及适宜的饲喂时间要做进一步的试验进行研究分析。

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Effect ofForsythia suspensa,Coptidis rhizoma,Andrographis paniculataon Blood Antioxidant Parameters inCynoglossus semilaevis

GE Jing, GUO Yong-junCorrespondingAuthor, WANG Qing-kui, XU Da-wei, SUN Xue-liang,
CHEN Cheng-xun, XING Ke-zhi
（Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

The study was conducted to understand the effect ofForsythia suspensa,Coptidis rhizoma,Andrographis paniculataon the blood antioxidant function inCynoglossus semilaevis. A factorial experiment was designed to evaluate the blood parameters（the total superoxide dismutase（T-SOD）, total antioxidant capacity（T-AOC）, catalase（CAT）, malonaldehyde（MDA）, triglyceride（TG）, total cholesterol（T-CHO））inC. semilaevisafter 7 days, 14 days and 21 days. Fish were fed diets containing different doses ofF. suspensa,C. rhizoma,A. paniculata（0, 5, 10, 15 g/kg）. The results, diet supplemented with 5 g/kgF. suspensaresulted in significantly highest T-SOD activity after 14 days, diet supplemented with 5 g/kg ofF. suspensaresulted in significantly highest CAT activity 21 days, diet supplemented with 15 g/kgF. suspensaresulted in significantly lower MDA content than the control group after 14 days. Diet supplemented with 15 g/kgC. rhizomaresulted in significantly highest T-SOD activity after 14 days. Diet supplemented with 15 g/kg ofC. rhizomaresulted in significantly higher T-AOC activity than the control group after 21 days. Diet supplemented with 10 g/kgA. paniculataresulted in significantly highest T-SOD activity, CAT activity and T-AOC activity after 14 days. Diet supplemented with 5 g/kgA. paniculataresulted in significantly lower MDA content than the control group after 21 days. Diet supplemented with 10 g/kgA. paniculataresulted in significantly higher T-CHO content and TG content than the control group after 7 days. The results indicated thatF. suspensa,C. rhizoma,A. paniculataadded individually had different degrees of influences on blood antioxidant parameters inC. semilaevis.

Forsythia suspense;Coptidis rhizoma;Andrographis paniculata;Cynoglossus semilaevis; antioxidant parameters

S963

A

1008-5394（2016）04-0021-07

2016-03-28

国家星火计划项目“渔用中草药添加剂的开发与应用”（2013GA610002）；国家自然科学基金面上项目“当归多糖对点带石斑鱼非特异性免疫和抗氧化机理的研究”（31270456）；天津市科技支撑计划项目“中草药在水产健康养殖中的应用与开发”（13ZCZDNC00700）；天津市高等学校创新团队基金项目“现代水产生态健康养殖”（TD12-5018）

葛婧（1989-），女，安徽亳州人，硕士在读，研究方向：水产动物病害防治与免疫学。E-mail：532462825@qq.com。

郭永军（1969-），男，天津市人，研究员，硕士，研究方向：水产动物病害防治与免疫学。E-mail：guoyongjun@tjau.edu.cn。