小鼠种质资源冷冻保存技术及研究进展

洪胜辉，王芊芊，陈晓娟，刘迪文

(浙江大学 实验动物中心，浙江 杭州 310058)



小鼠种质资源冷冻保存技术及研究进展

洪胜辉，王芊芊，陈晓娟，刘迪文

(浙江大学 实验动物中心，浙江 杭州 310058)

摘要：20世纪80年代以来，随着转基因、基因敲除等生物工程技术的不断发展，Cas9等基因编辑技术的不断涌现，由此产生大量的生物工程小鼠。建立一种常规、安全、可靠的种资保存方法，保存这些极其珍贵的生物资源至关重要。本文综述了当前广泛应用的冷冻保种技术方法。

关键词：小鼠；胚胎冷冻；精子冷冻；卵巢冷冻

动物种质保存通常有活体保种、冷冻保种和基因克隆三种方法。长期活体保种，不仅需要大量的空间和维持经费，还有可能在繁殖的过程中发生遗传漂变和污染。基因克隆只能保持物种的遗传信息，但是无法保存种质；冷冻保种，可有效的防止种群的遗传漂变，遗传资源丢失和污染，还可以减轻繁育工作者的负担，因此成为当前应用最广泛的方法。在长达半个世纪的研究中，胚胎冷冻、精子冷冻等技术取得了快速发展，为生命科学研究提供基础。由于国际资源共享愈来愈频繁，活体的运输由于其笨重、易受污染等缺点受到极大限制，以冷冻胚胎和精子形式的运输发挥了巨大作用。

1冷冻保存的基本原理

通过一定的保护措施和降温程序，将胚胎或者细胞保存在-196℃条件下，细胞代谢作用暂时停止或者减弱到足够小的程度，当使用一定的措施和升温程序，细胞又能够恢复代谢的能力，从而能够长期保存，这就是冷冻保存技术。

细胞冷冻保存的关键是防止在降温或者解冻的过程中，过多过大冰晶的产生，冰晶能够刺伤胞质或者胞膜，导致细胞死亡。胚胎是发育中的细胞，细胞内含水量高达80%以上，冷冻过程中会有90%的水分形成游离水而形成冰晶。为了减小细胞在冷冻过程中的损伤，冷冻保护剂应运而生。常用的冷冻保护剂分为渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。渗透性保护剂是小分子物质，如甘油、乙二醇、DMSO、丙二醇等，可通过细胞膜进入细胞内，与水结合后，使水的冰点下降，使之不易形成冰晶，从而起到冷冻保护作用。非渗透性冷冻保护剂，分子量大，如蔗糖、聚蔗糖、海藻糖和棉子糖等多元醇，在冷冻过程中不进入细胞内，通过提高细胞外液渗透压，使细胞内的水分充分外流，从而减少冰晶形成，达到冷冻保护的目的。

2小鼠胚胎冷冻保种

2.1小鼠胚胎冷冻研究进展

小鼠是模式动物，因而小鼠种质资源的保存至关重要。事实上，绝大部分胚胎冷冻技术的发展，冷冻保护剂的研究都是以小鼠胚胎为模型，从早期的慢速冷冻到如今的玻璃化冷冻。

随着转基因、基因敲除技术的发展，各种遗传修饰小鼠的数量越来越多，长期保存这些珍贵的品系是一项复杂而重大的工程。普遍认为，玻璃化冷冻技术无论在速度、操作难度以及复苏后胚胎的存活率方面都更为先进。1985年，Rall和Fahy用高浓度的二甲基亚砜(DMSO)、乙酰胺(AC)、丙二醇(PG)和聚乙二醇(PEG)混合组成玻璃化液，对8细胞期小鼠胚胎进行一步冷冻获得成功，胚胎解冻后培养发育率达87.5%。1989年，Nakagata将DMSO、AC、PG按照2 mol/L、1 mol/L、3 mol/L混合成冷冻保护剂，简称DAP213法[2]。1990年，Kasai等[3]利用乙二醇(Ethylene glycol，EG)代替DMSO，加上聚蔗糖(Ficoll70)和蔗糖制备了EFS40冷冻保护剂冷冻胚胎，取得了很好的效果，随后发展的EFS20/40冷冻胚胎，效果更佳，称为EFS方法[4]。此外，还有Schefen的GP25法(用甘油和丙三醇制备冷冻保护液)[5]。

近20年来，为了寻找高效、低毒的冷冻保护剂，研究人员做了大量的研究。Liu等[6]分别用PROH、EG和甘油作为冷冻保护剂，并分别采取慢速冷冻和玻璃化冷冻方法冻存小鼠8细胞胚胎。实验结果为，当采用慢速冷冻时，PROH冷冻的8细胞复苏存活率、囊胚发育率明显高于DMSO和甘油，和EG相比没有明显差别。当采用玻璃化法冷冻时，EG作为冷冻保护剂，8细胞的存活率和囊胚发育率明显高于PROH、EG和甘油，而后三者之间没有明显差别。结果表明PROH更适合8细胞慢速冷冻，而EG更适合于玻璃化冷冻。2011年，Ogura实验室对Kasai 的EFS方法做了一些改进，他们将塑料麦管替换成冻存管，先将少量EFS40溶液加入冻存管中，然后在室温下将胚胎置于EFS20中平衡2 min，之后将脱水的胚胎吹入冻存管中，投入液氮中保存(如图1)。这种方法冻存复苏操作方便，胚胎复苏存活率能达到95%以上，囊胚发育率在90%左右，移植生仔率在50%～60%[5]。

2.2胚胎冷冻的方法

常规的胚胎冷冻方法有慢速冷冻法、快速冷冻法和玻璃化冷冻方法。1971年Whittingham等建立了缓慢冷冻法[6]。将胚胎置于冷冻保护剂(cryoprotectiveagent，CPA)中，利用不同温差的冰箱分阶段降温或者程控降温仪匀速降温，一般降温速度为0.2～0.8℃/min，降到-80℃时，放入液氮中(-196℃)保存。在此基础上发展了诱导结晶冷冻法，先以1℃/min的速度降温至-6℃～-7℃时植冰诱导结晶，再以0.1～0.3℃/min 的速率降温至-30℃～-35℃后投入液氮保存。这种冷冻程序方法比较成熟，广泛应用在牛、羊、马等动物。慢速冷冻法采用的冷冻保护剂毒性小，胚胎复苏存活率和移植率较高，但是操作繁琐，费时较长，且需控温仪器，实验成本较高。Wood等于1980年提出了二步冷冻法，即在室温下，将胚胎置于冷冻保护剂中平衡脱水一定时间后，先迅速降温至-20℃～-60℃，平衡一段时间后直接投入液氮中保存。此种方法在小鼠、牛、兔上试验都获得成功。在二步冷冻法的基础上又发展了一步冷冻法，此法采用渗透性保护剂和非渗透性保护剂组合的混合液(主要是甘油和蔗糖)，在室温下平衡脱水一定时间后，直接在液氮蒸汽中停留片刻后投入液氮保存[7]。在这些方法的基础上，在简化操作步骤，节省时间的原则下，研究人员不断改进优化，发展了玻璃化冷冻方法。玻璃化冷冻方法是将渗透性保护剂与非渗透性保护剂按照一定的比列，组成玻璃化的保护剂，这种溶液在低温下呈现黏稠透明的状态，不发生结晶即可固化，此固体物质能保持分子和离子正常的液态分布，是一种超快速冷冻模式[2，8]。 Rall 和Fahy 1985年首先报道了这种方法。玻璃化冷冻使用高浓度的低温保护剂，操作简单，不需要昂贵的设备。只需将胚胎用玻璃化液处理，短暂平衡脱水，然后直接投入液氮。 玻璃化冷冻保护剂最主要的是DMSO和乙二醇。自玻璃化冷冻发现以来，人们在不断的探索简单、高效、低毒的冷冻保护剂。

2.3胚胎解冻方法

胚胎解冻的方法一般依据冷冻时的速度，通常慢速冷冻采用慢速解冻法，解冻速度不超过25℃/min。快速冷冻采用室温或者37℃水浴解冻，然后用蔗糖溶液洗脱。玻璃化冷冻法一般用37℃快速解冻，而后用梯度蔗糖溶液洗脱保护剂[9]。

3小鼠精子冷冻保存技术

3.1小鼠精子冷冻的研究进展

与胚胎冷冻保存相比，精子冷冻保种更加方便、快速，不需要通过繁殖更多的母鼠来超排获取胚胎，只需要2～3只雄鼠，因而成本更低。

自1949年Polge 和Smith等[10]偶然发现低温保存的精子具有活力以来，精子冷冻保种技术已经广泛运用于家畜的繁殖、人不育症的治疗和濒危动物的保存。但是由于精子结构的特殊性，小鼠精子膜具有较低的水渗透性和较长的尾巴，且精子的遗传物质高度浓缩于精子头部，胞外物质极少，因而精子极易受损，对冷冻损伤也极为敏感。如今，实验室广泛采用Nakagata的R18S3法冷冻小鼠的精子[11]，获得了较好的结果。与此同时，各个实验室在原有R18S3方法的基础上，不断优化发展，使小鼠冷冻精子体外受精的受精率不断提高，为建立遗传工程小鼠精子库提供基础。下文将从精子冷冻的保护剂、冷冻方法、解冻和复苏方法，以及影响精子冷冻保存的因素来阐述精子冷冻方法的发展。

3.2精子冷冻保护剂

与胚胎冷冻原理类似，精子的冷冻保存同样要克服冷冻过程中冰晶的产生及高溶质产生的“溶液效应”。因而，选择一种恰当的冷冻保护剂对于冷冻精子复苏后活力的恢复至关重要。R18S3是目前冷冻精子较为成熟的方法，它是由18%的棉子糖和3%脱脂奶粉组成[11]。这种冷冻保护剂可以冷冻不同品系的小鼠，包括转基因小鼠。2008年，美国Jackson实验室研究12个常用遗传工程背景鼠精子冷冻发现，在R18S3溶液中添加477μm/L的硫代甘油能够提高小鼠冷冻精子体外受精率到70%[12]。2010年，Nakagata研究发现在R18S3溶液中添加100 mol/L的 L-谷氨酰胺，能够提高冷冻精子复苏后的体外受精率。分析认为：冷冻保护剂中添加L-谷氨酰胺能够减少精子在冷冻过程中的损伤，从而提高冷冻精子的活力，而精子获能液中添加MBCD能够促使精子释放更多的胆固醇，调控精子膜表面的离子通道[13]。

3.3冷冻方法

精子冷冻时，当温度下降到-6℃～ -10℃，原生质会发生结晶样硬化，原生质的结构受到破坏，精子死亡，而当精子温度接近0℃时，采用迅速冷冻，使精子迅速越过结晶硬化期，形成玻璃化，精子就不会死亡。因此，冷冻精子时，使用快速降温比缓慢降温效果更好[14]。R18S3法的过程是：先取出附睾，除去血液和脂滴，用手术剪剪开附睾，置于冷冻保护剂中37℃热台上平衡3 min，然后去除附睾组织，平均分成若干份，吸入麦管，封口后置于浮在液氮表面的浮标上平衡10 min，最后直接投入液氮中保存。

3.4解冻和复苏方法

近年的研究表明，冷冻精子的解冻快速升温是最佳的。Jackson实验室比较了54℃水浴和37℃水浴解冻精子的效果。结果表明，37℃解冻复苏的精子体外受精后2细胞胚胎发育率比54℃水浴解冻高很多。其原因37℃水浴解冻复苏能够减少精子在复苏过程中所受的热损害[15]。解冻后精子的获能时间对体外受精率也有影响。Liu Ling 等[16]以TYH为精子获能液，研究了C57BL/6J小鼠冷冻精子复苏后获能时间对体外受精率的影响。实验结果表明，获能20 min 或者获能45min体外受精率没有明显差别，但都显著高于60 min。Nakagata 的R18S3法冷冻的精子获能液为TYH加MBCD，冷冻精子经过37℃水浴10 min后，获能时间为30 min时，体外受精率最佳[13]。Jackson实验室的研究人员认为，由于冷冻过程影响了精子的发育，在体外获能过程中需要更多的时间才能发育成熟，因而他们采取的方法是解冻时间短暂，37℃水浴5 s后，直接加入获能液中获能60 min，通过延长获能时间使精子成熟后受精[12]。此外，不同的品系实验结果也不同，这需要研究者根据获能液、解冻时间等因素来确定后续的获能时间。

4小鼠卵巢冷冻保存

卵巢是雌性哺乳动物生殖系统的重要组成部分。在保种过程中，对于衰老或者突然死去以及遗传工程修饰的繁殖能力低的珍贵雌鼠的卵巢予以及时冷冻保存。需要时，可通过解冻卵巢，移植入其他小鼠体内发育获得成熟卵泡。

4.1卵巢冷冻的方法

卵巢冷冻的基本原理与胚胎冷冻的原理类似，在20世纪90年代初期，小鼠、大鼠、兔、猴、牛等的卵巢组织玻璃化冷冻均获得成功。但是目前世界上卵巢玻璃化冷冻方法还未形成一个标准的方法可参考，通常的做法是将卵巢组织切成1 mm的小块，也有将卵巢整个进行冷冻。先在较低浓度的玻璃化冷冻保护剂中平衡数分钟，然后加到高浓度的冷冻保护剂中，投入液氮中保存。

常用的卵巢组织冷冻保护剂有甘油、乙二醇、丙二醇、二甲基亚砜等小分子渗透性保护剂以及蔗糖、棉子糖等大分子非渗透性保护剂。渗透性与非渗透性保护剂的联合使用，制成高效低毒的玻璃化冷冻保护剂是卵巢组织冷冻的研究方向[17]。

4.2卵巢移植技术

理论上的移植方法有异种移植、异位自体移植、原位移植。目前采用的卵巢移植方法为异体原位移植：将衰老或者突然死亡的雌鼠卵巢整个取出，冷冻后移植或者新鲜移植入近交系小鼠卵巢覆膜内。移植前选择健康发情正常的小鼠受体，摘除整个卵巢，然后将要移植的卵巢移进卵巢覆膜，缝口饲养一定时间后，用雄鼠与受体雌鼠交配，检查见栓及产仔情况。

5参考文献

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中图分类号：S865.1

文献标识码：B

文章编号：1005-2739(2016)03-0008-04

作者简介：洪胜辉(1986-)，男，硕士，初级实验员。通讯作者：刘迪文(1957-)，男，研究员。

收稿日期：2016-02-15