结核病诊断技术新进展

王森，张文宏

复旦大学附属华山医院感染科，上海 200040

·综述·

结核病诊断技术新进展

王森，张文宏

复旦大学附属华山医院感染科，上海 200040

摘要：结核病疫情亟需快速、有效的诊断方法，但长久以来其诊断一直依靠传统的结核分枝杆菌抗酸染色涂片和培养技术，并不能满足快速诊断的需要。为解决这个全球性的问题，近年来出现了多种结核病新的诊断技术和方法，如新的影像学检查及计算机辅助技术、显微镜学诊断技术、结核分枝杆菌快速培养技术、免疫学诊断技术，以及结核分枝杆菌特异性核酸扩增技术。本文主要介绍几种最有代表性的技术和方法，其中部分技术已获得世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的推荐，部分正在进行大规模临床研究或验证，反映了近年来结核病诊断发展的新方向。

关键词：结核分枝杆菌；诊断；核酸扩增技术

目前，全球的结核病(tuberculosis，TB)负担仍很重。中国疾病预防控制中心2010年全国结核病流行病学抽样调查资料显示，我国结核病年发病例约为100万，年死亡病例5.4万，其中每年新发耐多药结核(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)患者约10万例。结核病疫情亟需有效的诊断和治疗手段。长久以来，结核病诊断一直依赖传统的结核分枝杆菌抗酸染色涂片和培养技术，但痰涂片的灵敏度较差，且存在标本获取的问题；培养所需时间较长，不能满足快速诊断的需要。随后，以细胞免疫为基础的结核分枝杆菌γ干扰素释放试验(interferon γ release assay，IGRA)获得了飞速发展和广泛应用。该项技术以T-SPOT.TB和QuantiFERON-TB Gold试剂盒为代表，能区分结核分枝杆菌感染与卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)接种，特别适用于BCG广泛接种的地区[1-2]，但无法区分活动性结核病与潜伏性结核感染。不久，以结核分枝杆菌特异性核酸扩增技术(nucleic acid amplification technology，NAAT)为代表的分子诊断技术获得了较快发展。目前，新的结核病诊断技术分成以下几个方向：①影像学技术及计算机辅助诊断技术；②显微镜学诊断技术；③结核分枝杆菌快速培养技术；④活动性结核病和潜伏性结核感染的免疫学诊断技术；⑤分子诊断技术：包括病原体检测及耐药检测。本文总结了近几年来结核病诊断领域中新的诊断技术，其中着重介绍已获得世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐或通过初步验证并正在大规模评估的新技术和新产品。

1影像学技术及计算机辅助技术

X线胸片检查仍被WHO推荐用于结核病疑似患者筛查，特别是在低收入和条件受限制的地区。数字化X线摄影(digital radiography，DR)操作便捷，获得结果迅速且费用较低，诊断结核病有较高的灵敏度和特异度。最近，在DR胸片的基础上建立了计算机辅助图像分析系统，直接通过软件对DR图像进行分析。这种软件的应用使X线胸片检查不再需专业技术人员或影像学专家读片，更适用于人员和技术匮乏的地区[3-5]。该软件由挪威Radboud大学开发，称为CAD4TB系统，已发展至第4代，软件同时提供电脑版本和手机APP版本下载。CAD4TB系统的主要工作流程是对X线胸片图像中的可疑病灶进行搜索，包括肺部阴影、畸变和空洞等，然后与数据库中的图像进行比对和计算，最终得出结果。CAD4TB系统能自动对图像进行分析，1 min内就能获得诊断结果。研究表明，以结核分枝杆菌培养结果为金标准，CAD4TB软件的分析结果与人工读片相比较未见显著差异[3-4]。CAD4TB系统另一大优点在于配合便携式DR的应用，可建立移动式检查站，直接到结核病流行地区进行筛查，不需特殊专业人员，还大大降低了筛选成本[5]。最新研究表明，首先通过X线胸片和CAD4TB筛选出疑似结核分枝杆菌感染者，然后通过分子检测如Xpert MTB/RIF等进一步明确并进行耐药测定，与直接应用Xpert MTB/RIF筛选相比，成本降低一半以上，且准确率无显著差异[3]。

2显微镜学诊断技术

显微镜下痰标本中结核分枝杆菌检查是确诊肺结核病最特异性的方法。涂片抗酸染色镜检快速、简便，采用苯酚复红抗酸染色及金胺O-罗丹明等荧光染料涂片镜检仍是在临床标本中检测结核分枝杆菌的主要依据，被WHO推荐并广泛使用。荧光显微镜检测在一定程度上提高了检测结核分枝杆菌的灵敏度，但其对光源的严格要求限制了荧光显微镜的广泛应用。近年来，发光二极管(light-emitting diode，LED)荧光显微镜的出现完美结合了LED光源与荧光显微镜技术。与传统的荧光显微镜相比，LED使用寿命更长，价格更低廉，不需复杂的光路调节和暗室操作。由于LED荧光显微镜在结核分枝杆菌检测方面的优异表现，WHO于2011年推荐LED显微镜逐步取代传统的荧光显微镜，并可作为以Ziehl-Neelsen染色为基础的传统光学显微镜检测的替代方法[6]。最近又发展了建立在荧光染色基础上的全自动化读片系统TBDx(Applied Visual Sciences Inc.，USA)，将荧光染色后的涂片标本放入TBDx系统，可自动读取并报告检验结果，每小时能处理10～12张涂片，其诊断准确率与专业人员判断结果无显著差异[7]。

3结核分枝杆菌培养技术

结核分枝杆菌培养是结核分枝杆菌检测和药敏试验(drug sensitivity testing，DST)的金标准。传统的罗氏培养法耗时较长，需4～6周。液体培养系统如Bactec MGIT 960(BD Diagnostics, Sparks, Maryland，USA)提供了较传统固体培养更为敏感和快速的方法，1～3周即可检测到分枝杆菌的生长。分枝杆菌生长指示管法(mycobacterial growth indicator tube，MGIT)中，管底含荧光复合物，可被氧气淬灭。当分枝杆菌生长时，管内氧气逐渐被消耗即可探测到管底的荧光复合物。MGIT技术不到8 d即可显示结果。自动化MGIT还可通过添加临界浓度的链霉素、异烟肼、利福平和乙胺丁醇进行药敏检测。目前，WHO和结核战略技术顾问组推荐在有条件的地区逐步启用液体培养，包括低收入国家。另外一种改良液体培养方法称为TK SLC-L结核分枝杆菌快速培养系统，通过液体培养基颜色改变(红色变为黄色)可检测到结核分枝杆菌的早期扩增，并可区分真菌及其他革兰阴性杆菌的污染。研究结果表明[8]，与MGIT方法相比，TK SLC-L将报告时间缩短至3～5 d，且污染概率较低。TK SLC-L液体培养基在结核病诊断中的应用还在进一步评估和验证中。

4活动性结核病和潜伏性结核感染的免疫学诊断技术

以细胞免疫反应为基础的IGRA如T-SPOT.TB和QuantiFERON-TB Gold检测近年来获得了较好发展并广泛应用，但仍存在一定问题：诊断灵敏度有待提高，会出现无法判定结果的情况；无法区分活动性结核病与潜伏性结核感染；无法预测潜伏性感染者的活动风险等。改进IGRA的研究一直在进行，如增加新的诊断抗原、增加IFN-γ以外的诊断标记等。Qiagen公司2015年底公布了新一代结核诊断试剂盒QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT®-Plus) (http://www.quantiferon.com)。QFT®-Plus含4根采血管，管壁上分别包被有阳性对照、阴性对照和两个结核分枝杆菌特异性抗原。与上一代产品相比，新产品宣称第一次加入了CD8+T细胞应答数据，可对潜伏性感染发展为活动性结核病的风险进行评估，并改进了工作流程，提高了操作效率，便于同时对多个样本进行检测。

IFN-γ诱导蛋白10(interferon γ-induced protein 10，IP-10)又称为CXC-10，是CXC家族成员。它是一种促炎趋化因子，主要由炎症部位的单核-巨噬细胞分泌，这些细胞受T细胞释放的IFN-γ和其他促炎因子刺激后释放IP-10。研究表明[9]，IP-10与炎症反应所造成的急性肺损伤有关，并与结核分枝杆菌感染密切相关。IP-10的释放水平与IFN-γ有一定的相关性，但释放量为IFN-γ的10～100倍。近期一系列研究表明，建立在现有IGRA的基础上，IP-10可作为一种新的诊断标记。2014年，Guo等对14项IP-10诊断研究数据进行的Meta分析表明，IP-10诊断结核分枝杆菌感染的总灵敏度为73%(95%CI：71%～76%)，特异度为83%(95%CI：81%～86%)，其诊断活动性结核病的曲线下面积为0.88[10]。这些研究均表明，IP-10可作为诊断结核分枝杆菌感染的生物标记，从而提高诊断准确率。此外，由于IP-10释放水平较高，理论上用少量标本即获得检测数据，因此可采指尖血而不用静脉血进行检测。目前已能直接对滤纸上的指尖血斑点进行IP-10水平检测，操作简便易行，可用于诊断或监测结核病治疗效果[11]，正在进行大样本和多地区的临床研究。

近年来还出现了一项新的免疫学检测技术，即Determine TB-LAM Ag(Alere, Waltham, MA, USA)免疫检测试纸条，用于检测尿液标本中的脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan，LAM)抗原。LAM是相对分子质量为17 500的糖脂成分，是分枝杆菌细胞壁的组成成分[12]，能被肾小球滤过并在尿液中测出，因此广泛用作结核分枝杆菌感染的诊断抗原[13]。Determine TB-LAM Ag直接检测人尿液标本，加入试纸条后，无需做任何处理。若检测到LAM抗原，则试纸条上出现条带，全过程仅需25 min。由于LAM抗原在结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌中存在交叉反应，所以不能区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。一项在人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染人群中的检测结果表明，Determine TB-LAM Ag在全血标本中的检测灵敏度较高，且与HIV感染患者的CD4+细胞计数有很大关系[14]。结核分枝杆菌感染是HIV感染患者最重要的致死原因之一，特别是在CD4+细胞计数较低者中。在此类人群中，痰涂片及培养等方法的灵敏度和特异度较低，迫切需要更为简便快捷、准确率更高的检测方法。Determine TB-LAM Ag能方便快捷地检测HIV感染患者中的结核分枝杆菌感染。另一项南非的描述性研究表明[15]，Determine TB-LAM Ag检测在CD4+细胞计数低的人群中具有较高的灵敏度，在CD4+细胞计数<50/μL的患者中为66.7%，在<100/μL的患者中为51.7%，在<200/μL的患者中为39.0%，特异度在各人群中均>98%。Determine TB-LAM Ag联合痰涂片检测，在CD4+细胞计数<50/μL的患者中灵敏度为72.2%。与Xpert MTB/RIF检测相比，灵敏度无统计学差异。因此，在CD4+细胞计数较低的HIV感染患者中，Determine TB-LAM Ag检测可作为现有诊断方法的补充，与痰涂片方法联合应用具有较高的灵敏度[16]。

5分子诊断技术

结核分枝杆菌分子诊断技术近几年出现了突破，其标志就是以Xpert MTB/RIF为代表的盒式诊断技术。Xpert MTB/RIF 检测试剂盒为美国Cepheid公司开发，适用于GeneXpert仪器，可直接从患者新鲜痰液或冻存痰液中检测结核分枝杆菌及其对利福平的耐药性，整个过程在一密闭环境中进行，手动操作时间不超过5 min，对操作者和周围环境安全，全程约2 h即获得结果。Xpert MTB/RIF以半套式实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增技术为基础，能自动抽提DNA并扩增rpoB基因。由于95%以上的利福平耐药菌株有rpoB基因变异，所以在扩增rpoB基因的同时可鉴定是否为利福平耐药菌株；而大部分利福平耐药菌株同时对异烟肼耐药，因此rpoB基因的检测又可在一定程度上判断是否为MDR-TB菌株。2010年《新英格兰杂志》公布了一项多中心研究结果，表明以培养法为参考标准，Xpert MTB/RIF的灵敏度为92.2%，特异度为99.2%[17]。此后，Xpert MTB/RIF在多个国家和地区完成了诊断效果的研究和评估，其作为疑似结核分枝杆菌感染的初筛方法，总灵敏度为88% (95%CI：83%～92%)，特异度为98% (95%CI： 97%～99%)[18]。Xpert MTB/RIF也被证实可用于儿童结核病、肺外结核病及对非痰标本的检测，均具有较好的诊断效能[19-21]。

2010年12月，WHO首次推荐Xpert MTB/RIF技术的使用。截至2014年3月，共有104个国家采购了超过2 300台GeneXpert检测仪器和超过600万个Xpert MTB/RIF标本收集盒。2013年，WHO再次更新了对Xpert MTB/RIF的推荐意见[22]：Xpert MTB/RIF被强烈推荐作为成人和儿童怀疑MDR-TB感染或合并HIV感染的首选检测方法，从而替代传统的涂片镜检、培养和药物试验方法；被推荐对疑似肺外结核患者的肺外标本如脑脊液、淋巴结和其他组织进行检测；还被推荐用于痰镜检方法的后续检测，特别是对于痰涂片检测阴性的患者。

另外一种结核分枝杆菌分子检测技术称为TB-LAMP，核心为环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。LAMP是一种快速、简便、有效的DNA扩增方法，是一种手工NAAT。LAMP的特点在于扩增速度较快，检测结果可在2 h内完成，且DNA扩增不需热循环仪器，不依赖特殊检测设备。TB-LAMP采用结核分枝杆菌特异性引物，可视化荧光发光检测，在全封闭系统中进行，可减少工作场所DNA污染，从而保证检测的准确率[23]。TB-LAMP已在发展中国家进行的验证显示，其在痰涂片阳性结核病患者中的灵敏度为97.7%；在痰涂片阴性患者中的灵敏度为48.8%，特异度为99.0%。结果证实TB-LAMP是一种功能强大的检测方法，具有高度稳定性及成功率。即使是没有分子生物学实验经验的人员，也可熟练操作[24]。初步临床研究证实，TB-LAMP检测具有较高的灵敏度和特异度。目前，TB-LAMP在FIND基金资助下正在全球14个国家和地区开展大规模的临床研究，并与LED显微镜和Xpert MTB/RIF进行了头对头的比较，其中在冈比亚的研究结果已于2015年12月发表，证实其诊断结核病的总灵敏度为99%，特异度为94%[25]。

综上所述，全球结核病疫情亟需快速、简便的诊断技术，已有多种有潜力的新诊断方法被开发并进行了广泛评估，其中有些方法如Xpertt MTB/RIF已通过WHO评估并获得推荐，更多的方法还在进行临床试验和评价中。相信在不久的将来，新技术的应用将使人们更快、更迅速地发现结核分枝杆菌感染，从而更好地为结核病预防和治疗服务。

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New progress on diagnosis of tuberculosis

WANG Sen, ZHANG Wenhong

Department of Infectious Disease, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China

Abstract:The epidemic of tuberculosis worldwide urgently requires quick and effective diagnostic method. However for a long time, the diagnosis of tuberculosis has been relying on the traditional acid-fast staining of smears and selective Mycobacterium tuberculosis culture techniques, which cannot meet the need for rapid diagnosis. To match this global clinical need, many new tuberculosis diagnostic techniques and methods have been developed in recent years, such as new imaging and computer-aided techniques, automated microscopy, short time culture-based diagnosis, immunological diagnosis, and Mycobacterium tuberculosis-specific nucleic acid amplification technology. This paper describes the representative of the techniques and methods, some of which have already been recommended by World Health Organization (WHO), some have been investigated under large-scale clinical studies. These new technologies reflect the future direction in the diagnosis of tuberculosis.

Key words:Mycobacterium tuberculosis; Diagnosis; Nucleic acid amplification technology

基金项目：国家自然科学基金(81301481)

通信作者：张文宏

Corresponding author. ZHANG Wenhong. E-mail: zhangwenhong@fudan.edu.cn

(收稿日期：2015-12-28)