依达拉奉对心肌梗死大鼠心肌caspase-3 mRNA表达及血清TNF-α、IL-6水平的影响

刘品刚，张松，万镇，范修才

(1南通大学附属建湖医院，江苏建湖 224700；2 上海交通大学附属新华医院)



依达拉奉对心肌梗死大鼠心肌caspase-3 mRNA表达及血清TNF-α、IL-6水平的影响

刘品刚1，张松2，万镇1，范修才1

(1南通大学附属建湖医院，江苏建湖 224700；2 上海交通大学附属新华医院)

摘要：目的探讨依达拉奉对心肌梗死大鼠心肌半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达及血清TNF-α、IL-6水平的影响。方法取大鼠60只，其中20只为假手术组，余40 只采用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法制作心肌梗死模型后24 h随机分为心肌梗死组和依达拉奉组各20只。依达拉奉组术后每天静脉注射依达拉奉 10 mg/ kg，其他两组静脉注射等量生理盐水。4周后检测各组血清TNF-α、IL-6水平及左心室非梗死区心肌组织中caspase-3 mRNA的表达，超声心动图检测大鼠左室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(FS)。 结果血清TNF-α、IL-6水平及非梗死区心肌组织caspase-3 mRNA表达心肌梗死组、依达拉奉组均高于假手术组，依达拉奉组低于心肌梗死组(P均<0.05) 。心肌梗死组、依达拉奉组与假手术组比较，LVEDD增大，LVEF、 FS降低(P均< 0.05)；依达拉奉组较心肌梗死组LVEDD缩小，LVEF、FS升高(P均<0.05)。结论依达拉奉可能通过降低心肌梗死大鼠血清TNF-α、IL-6水平及非梗死区心肌组织caspase-3 mRNA表达发挥心肌保护作用，改善心脏功能。

关键词：心肌梗死；依达拉奉；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；肿瘤坏死因子α；白细胞介素-6；大鼠

依达拉奉是一种新型氧自由基清除剂，能够减轻氧自由基导致的级联损伤，具有心肌保护作用，其在心肌缺血再灌注中的作用及其机制是近年研究的热点[1~5]。心肌梗死后心肌细胞凋亡及炎症反应是心力衰竭和心肌重构的重要环节，其中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、TNF-α、IL-6在心肌细胞凋亡及炎症反应中起重要作用。2013年10月～2014年9月，我们观察大鼠心肌梗死后心肌caspase-3 mRNA表达、血清TNF-α、IL-6水平及心功能的变化，并探讨依达拉奉对以上变化的影响。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级健康雄性SD大鼠60只，许可证号 SYXK(浙)2005-0072，3个月龄，体质量(210±40)g，室温(23±2)℃下普通饲料喂养。

1.2 心肌梗死模型制作 大鼠适应性喂养1周后用2.5%戊巴比妥钠溶液 (30 mg/kg)腹腔注射麻醉，行气管插管，呼吸机辅助呼吸，依次切开周围组织，暴露心脏，用镊子撕开靠中部心包，挤出心脏。掀开左心耳，于左心耳下方 2～3 mm处进针，缝扎的中点在左心耳和肺动脉圆锥的交界部位与心尖连线上，以5-0号无损伤缝合线缝扎冠状动脉左前降支(LAD)，进针深度约1.5 mm。心肌梗死模型制作成功的标志：心电图Ⅰ导联和AVL导联ST段立即弓背向上抬高，结扎下方大面积心肌表面发紫、肿胀、室壁运动减弱。

1.3动物分组及处理 60只大鼠随机分为三组。20只为假手术组，手术仅在LAD下留置丝线，不结扎。40只按上法心肌梗死模型制作成功后24 h再随机分为心肌梗死组和依达拉奉组各20只。依达拉奉组每天给予依达拉奉 10 mg/kg静脉注射，心肌梗死组和假手术组给以等量生理盐水静脉注射，持续4周。4周后假手术组、心肌梗死组、依达拉奉组存活大鼠分别为19、12、16只。

1.4左室功能检测大鼠麻醉后，采用二维超声心动图通过脉冲多普勒测定左室功能，包括左室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(FS)。

1.5血清TNF-α、IL-6水平检测大鼠麻醉后仰卧位固定，暴露下腔静脉，抽取静脉血5 mL予4 000 r/min离心10 min。吸取上层血清按试剂盒要求采用放免法检测TNF-α、IL-6水平。

1.6心肌caspase-3 mRNA表达检测大鼠麻醉后迅速开胸，剪下心脏，洗尽血液, 剪除左、右心耳及残余大血管后以滤纸滤干。于近心尖部非梗死区取200 mg心肌保存于-80 ℃冰箱中，采用RT-PCR法检测caspase-3 mRNA表达。提取心肌组织总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR扩增。取扩增产物6μL，琼脂糖凝胶电泳、照相、计算机扫描，以caspase-3与β-actin 电泳条带灰度值的比值作为心肌caspase-3 mRNA的相对表达量。

2结果

2.1 三组左室功能指标变化三组LVEDD、LVEF、FS比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1　三组LVEDD、LVEF、FS比较

注：与假手术组比较，*P< 0.05；与心肌梗死组比较，**P<0.05。

2.2三组血清TNF-α、IL-6水平及心肌caspase-3 mRNA表达变化三组血清TNF-α、IL-6水平及心肌caspase-3 mRNA表达比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2　三组血清TNF-α、IL-6水平及心肌caspase-3 mRNA

注：与假手术组比较，*P< 0.05；与心肌梗死组比较，**P<0.05。

3讨论

近年来研究显示，细胞凋亡在心肌梗死的发生、发展和心肌梗死后心室重塑中起着非常重要的作用。宋祖军等[6]研究认为，依达拉奉预处理对心肌梗死再灌注损伤具有保护作用，其可能的机制为依达拉奉能够提高超氧化物歧化酶活性，减轻氧自由基对细胞膜的损伤。有研究指出，依达拉奉通过抑制脂质自由基的生成及细胞膜脂质过氧化连锁反应，阻止氧自由基介导的核酸及蛋白质的不可逆破坏，从而保护缺血再灌注中的细胞损伤。Luo 等[7]发现，心肌梗死诱导内质网应激和引发心肌细胞凋亡和心肌纤维化，最终导致心脏破裂和心脏重塑。Zhang等[8]发现，乳酸和低剂量依达拉奉处理后可以通过线粒体途径减轻心肌再灌注损伤。Arumugam等[9]实验表明，依达拉奉通过调节氧化和内质网应激介导的心肌细胞凋亡和纤维化改善扩张心肌病的进展。Nakamura 等[10]研究发现，依达拉奉抑制血浆MCP-1水平升高，提高急性心肌梗死患者LVEF，并减少因心力衰竭的再住院率。

研究显示，炎症通路在梗死心肌修复和不良重塑中起着重要作用，针对炎症反应特异性成分的治疗方案对心肌梗死患者意义重大。依达拉奉可降低C反应蛋白水平，保持心肌细胞的正常超微结构，维持心肌细胞膜的完整性，从而减轻心肌梗死程度和其相关的氧化应激细胞凋亡和炎症反应达到心脏保护作用[11]。TNF-α作为一种重要的炎症细胞因子，通过增加原癌基因和诱生型一氧化氮合成酶的表达, 参与心肌细胞的凋亡过程。IL-6是调节免疫反应与炎性反应的多功能细胞因子，有调节心血管功能的作用。caspase-3是细胞凋亡因子，其心肌表达减少可改善左心室功能，对心肌有保护作用。本研究显示，依达拉奉处理大鼠心肌caspase-3表达及血清TNF-α、IL-6水平降低，心功能明显改善。因此认为，心肌梗死患者控制心肌caspase-3表达及血清TNF-α、IL-6水平可以减轻心肌梗死后的炎症反应及其损伤，减少并发症的发生；降低心肌caspase-3表达及血清TNF-α、IL-6水平可能是依达拉奉发挥心肌保护作用的重要机制。

参考文献：

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[6] 宋祖军，马俊清，余厚友, 等. 依达拉奉预处理对心肌缺血-再灌注损伤大鼠的保护作用 [J]. 医药导报,2009,28(10):1268-1270.

[7] Luo T,Kim JK, Chen B,et al. Attenuation of ER stress prevents post-infarction-induced cardiac rupture and remodeling by modulating both cardiac apoptosis and fibrosis[J]. Che Biol Inter, 2015,225(1):90-98.

[8] Zhang GM, Wang Y, Li XY, et al. Pharmacological postconditioning with lactic acid and low dose edaravone could attenuate myocardial reperfusion injury through mitochondrial pathway [J]. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi, 2013,41(8):647-653.

[9] Arumugam S,Thandavarayan RA, Veeraveedu PT, et al. Beneficial effects of edaravone, a novel antioxidant, in rats with dilated cardiomyopathy[J]. J Cell Mol Med, 2012,16(9):2176-2185.

[10] Nakamura Y，Yamada Y,Shimomura H，et al. Effect of edaravone on plasma monocyte chemoattractant protein-1 levels in patients with acute myocardial infarction[J]. J Cardio, 2009,54(3):416-424.

[11] Hassan MQ, Akhtar MS, Akhtar M，et al. Edaravone protects rats against oxidative stress and apoptosis in experimentally induced myocardial infarction: Biochemical and ultrastructural evidence [J]. Redox Rep, 2015,25(4):326-334.

(收稿日期：2015-09-19)

中图分类号：R542.2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)05-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.009

通信作者：刘品刚(E-mail:liupingang08@sina.com)

基金项目：盐城市医学科技发展计划项目 (yk2013094)。