β-arrestin2在内毒素诱导的肝脏损伤中的作用

蒋梦萍　禤婕滢　徐春　罗千江　尉秀清

510630 广州，中山大学附属第三医院消化内科



β-arrestin2在内毒素诱导的肝脏损伤中的作用

蒋梦萍禤婕滢徐春罗千江尉秀清

510630 广州，中山大学附属第三医院消化内科

【摘要】目的探讨β-arrestin2在内毒素诱导的肝脏损伤中的作用机制。方法建立内毒素诱导的肝脏损伤模型，将β-arrestin2基因敲除型(KO)小鼠20只及同窝β-arrestin2野生型(WT)小鼠20只分别随机分成实验组及对照组(n=10)，实验组腹腔内注射脂多糖(5 mg/kg)，而对照组注射等量生理盐水，6 h后留小鼠血清和肝脏组织标本。实时定量PCR检测小鼠体内 β-arrestin2表达量，ELISA检测各组小鼠血清中ALT、AST及TNF-α水平，蛋白免疫印迹法检测各组β-arrestin2、p-p65及p-IкBα蛋白的表达。结果β-arrestin2 WT 实验组肝脏组织中 β-arrestin2 mRNA为0.18±0.06，明显低于正常对照组的1.00±0.29(t=-4.669，P<0.001)，β-arrestin2蛋白表达也明显低于WT对照组；β-arrestin2 KO实验组血清ALT为(204.33±22.33) U/L、AST为(403.40±53.45) U/L，明显高于β-arrestin2 WT实验组ALT的(129.33±9.69)U/L和AST(256.20±40.47) U/L(t=7.55、6.94，P均<0.001)。β-arrestin2 KO实验组血清TNF-α为(155.89±14.89)pg/L，明显高于WT实验组的(101.36±10.65)pg/L(t=9.25，P<0.001)。β-arrestin2 KO实验组肝脏组织中p-IкBα及p-p65的蛋白表达量明显高于β-arrestin2 WT实验组。结论β-arrestin2可能通过抑制NF-κB活化、减少TNT-α释放从而减轻内毒素诱导的炎症反应，在内毒素诱导的肝脏损伤中起保护作用。

【关键词】内毒素诱导的肝脏损伤；β-arrestin2；TLR4/NF-кB/TNF-α信号通路

内毒素本质是革兰阴性细菌细胞壁上的脂多糖，当细菌裂解或其黏附在其他细胞上时脂多糖可释放出来。脂多糖是机体内诱发炎症反应的主要致病成分。肝脏既是清除内毒素的场所，也是内毒素血症过程中最易受损的器官之一。内毒素诱导的肝脏损伤是多种肝病的主要病理基础[1-2]。现有的大量研究表明，肝脏枯否细胞内激活多种信号通路诱发的炎症反应是内毒素诱导的肝脏损伤的关键机制[3]。β-arrestin2是Arrestins家族中成员之一，广泛表达于哺乳动物的各种组织细胞中，尤其是免疫系统；β-arrestin2可作为负调控因子介导受体脱敏和内吞[4]。除此之外，β-arrestin2可作为“鹰架”蛋白，参与多种信号通路[5-6]。本研究旨在观察β-arrestin2在内毒素诱导的肝脏损伤中的生物学作用，并探讨其可能的作用机制。

材料与方法

一、 实验动物

C57BL/6J背景的β-arrestin2+/-雌雄配对小鼠由美国杜克大学医学中心Robert J.Lefkowitz教授馈赠，在中山大学附属第三医院疫苗研究所动物中心按SPF级培育，该动物实验获得该院医学伦理委员会批准。

二、 实验试剂和仪器

1.主要实验试剂及抗体

脂多糖(Sigma，US)，ALT试剂盒(Cusabio，武汉)，AST试剂盒(Cusabio，武汉)，TNF-α ELISA试剂盒(Cusabio，武汉)，蛋白质定量试剂盒(Genstar，北京)，组织RNA提取试剂盒(Magen，北京)，qPCR逆转录试剂盒(TOYOBO，上海)，30%丙烯酰胺(BIO-RAD, US)，过硫酸钠(BIO-RAD，US)，TEMED(BIO-RAD，US)，β-arrestin2抗体(美国杜克大学医学中心Robert J.Lefkowitz教授馈赠)，p-p65抗体(Cell Signaling Technology，US)，p65(Santa Cruz，US)，p-IкBα(Santa Cruz, US)，IкBα(Santa Cruz, US)，GAPDH(Santa Cruz，US)等。

2.主要仪器

低温高速冷冻离心机(Eppendorf公司，Germany)，SDS-PAGE电泳槽(BIO-RAD，US)，转膜仪(BIO-RAD，US)，PCR仪(Labnet，US)，Nanodrop 2000微量紫外分光光度计(Thermo Scientific，US)等。

三、实验方法

1.内毒素诱导的肝脏损伤模型建立

选取6～8周龄(22～25 g)的雄性β-arrestin2基因敲除型(KO)小鼠20只及同窝来源的β-arrestin2野生型(WT)雄性小鼠20只，分别将它们随机分成实验组和对照组，每组10只。实验组小鼠腹腔注射5 mg/kg脂多糖，对照组小鼠注射等量的生理盐水。

2.标本采集与处理

6 h后，10%水合氯醛麻醉后行开腹手术，腹腔下静脉取血，迅速取肝脏组织，将部分肝脏组织放入10%中性福尔马林中固定制作石蜡标本，剩余部分保存于液氮中，待提取蛋白质或RNA；血浆在室温静置1 h后离心留血清保存于-80℃。

3.ELISA检测ALT、AST及TNF-α水平

根据各试剂盒说明书，检测各组血清中ALT、AST及TNF-α水平。

4.肝脏组织RNA提取及逆转录

取适量肝脏组织，按组织RNA提取试剂盒说明书进行提取RNA，并用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度，再根据qPCR逆转录试剂盒合成cDNA。

5.肝脏组织蛋白提取及蛋白质电泳

取适量肝脏组织，按蛋白质提取裂解液说明书提取组织总蛋白，并用BCA法检测蛋白浓度。分装蛋白并进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，转膜(PVDF膜)、封闭后，用相应目的蛋白的抗体孵育，4℃冰箱摇床过夜，其中对总蛋白分别用抗β-arrestin2、p-p65、p65、p-IкBα、IкBα的一抗孵育。次日复温30 min后，HRP标记的二抗孵育2 h，暗房曝光。

四、统计学处理

结果

一、 β-arrestin2 WT小鼠在腹腔注射脂多糖后实验组与对照组肝脏组织中β-arrestin2水平比较

腹腔注射脂多糖 6 h后观察，实验组小鼠均活动减弱，体毛寒立，蜷曲姿势，眼睛可见脓性分泌物，解剖时见肝脏肿胀较对照组略大。通过提取肝脏组织RNA，再检测β-arrestin2的表达量，实验发现β-arrestin2 WT小鼠腹腔注射脂多糖后肝脏组织中β-arrestin2 mRNA表达量0.18±0.06，对照组1.00±0.29，实验组比对照组低，此差异有统计学意义(t=-4.669，P<0.001，图1A)。进一步提取肝脏组织蛋白，通过蛋白免疫印迹法检测，发现小鼠在腹腔注射脂多糖后肝脏组织中β-arrestin2蛋白水平也明显下降(图1B)。

图1　β-arrestin2 WT小鼠注射脂多糖6 h后肝脏组织中β-arrestin2水平变化

A：β-arrestin2 WT实验组与对照组肝脏β-arrestin2 mRNA水平比较,*P<0.05；B：蛋白免疫印迹电泳图β-arrestin2 KO小鼠注射脂多糖后肝脏损伤加重

β-arrestin2 KO实验组的ALT、AST高于β-arrestin2 WT实验组，差异均有统计学意义(t=7.55，P<0.001；t=6.94，P<0.001)。β-arrestin2 KO实验组血清TNF-α为(155.89±14.89)pg/L，而其β-arrestin2 WT实验组血清中TNF-α为(101.36±10.65)pg/L，前者分泌更多TNF-α(t=9.25，P<0.001)，见表1。

表1　各组小鼠肝脏损伤情况比较

注：与β-arrestin2 KO对照组比较，aP<0.01；与β-arrestin2 WT实验组比较，bP<0.01；与β-arrestin2 WT对照组比较，cP<0.01

二、 β-arrestin2 WT组和KO组注射脂多糖6 h后肝脏损伤指标比较

比较β-arrestin2 WT实验组与β-arrestin2 KO实验组的肝脏组织中p-IкBα及p-p65蛋白的表达量，我们发现β-arrestin2 KO实验组高于β-arrestin2 WT 实验组(图2)。

讨论

有关肝脏损伤的研究仍是生物学领域的研究热点之一，而其中内毒素诱导的肝脏损伤是许多其他肝脏疾病的主要病理基础。大量研究表明，肝脏枯否细胞是肝脏内产生炎症递质的主要来源，它是机体防御内源性、外源性感染的重要效应细胞。脂多糖的受体是Toll样受体4(TLR4)，它在枯否细胞的细胞膜上大量表达，当脂多糖与其受体TLR4结合后可引发枯否细胞内一系列的信号通路激活从而诱导炎症反应[7]。激活后的枯否细胞可释放多种炎症介质，间接作用于肝细胞从而引起肝细胞的坏死、凋亡和损伤[8]。其中，TLR4/NF-кB 信号通路激活是内毒素诱导的肝脏损伤的重要机制之一，TNF-α一方面诱导中性粒细胞在肝内聚集，另一方面又可诱导激活肝内凝血系统，进一步加重肝脏损伤。

图2　β-arrestin2 WT实验组与β-arrestin2 KO实验组肝脏组织中p-IкBα及p-p65蛋白表达水平比较

β-arrestin2最早被发现是作为G蛋白偶联受体信号通路的重要负性调节因子，可介导细胞膜表面多种受体的脱敏和内吞作用。实际上，β-arrestin2是一种多功能“鹰架”蛋白。有研究发现β-arrestin2可以与IкBα 结合进一步干扰IкBα的磷酸化、降解和抑制NF-кB活化。另外有研究指出，在脂多糖或IL-1β刺激下，β-arrestins能直接结合肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)而阻止后者的寡聚化和泛素化。TRAF6和IкBα都是TLR4/NF-кB 信号通路中重要的信号分子；我们以此推测β-arrestin2可以负性调控TLR4/NF-кB 信号通路。在本实验中，我们的结果显示β-arrestin2 WT小鼠在腹腔内注射脂多糖(5 mg/kg)6 h后，肝脏组织β-arrestin 2 mRNA和蛋白表达均明显下降；接着我们发现β-arrestin2 KO实验组的炎症因子表达量高于β-arrestin2 WT实验组，而且前者的血清ALT、AST和TNF-α含量都高于后者，这说明了β-arrestin2 KO实验组的肝脏损伤情况比β-arrestin2 WT实验组的严重。β-arrestin2在内毒素诱导的肝脏损伤中起保护作用，在肝脏损伤过程，β-arrestin2表达受到抑制，进而内毒素引起的炎症反应更加强烈。同时，我们的结果分析提示了β-arrestin2起保护作用的机制可能与抑制NF-кB 磷酸化和核内移、减少TNF-α释放有关。

综上所述，β-arrestin2在内毒素诱导的肝脏损伤中起保护作用，其机制可能是抑制了NF-кB活化，减少促炎因子TNF-α释放，进而抑制内毒素诱导的炎症反应放大，但具体的分子机制尚需进一步深入研究。

参考文献

[1]Enomoto N, Ikejima K, Bradford BU, Rivera CA, Kono H, Goto M, Yamashina S, Schemmer P, Kitamura T, Oide H, Takei Y, Hirose M, Shimizu H, Miyazaki A, Brenner DA, Sato N, Thurman RG. Role of Kupffer cells and gut-derived endotoxins in alcoholic liver injury. J Gastroenterol Hepatol, 2000, 15(Suppl): D20-D25.

[2]Kudo H, Takahara T, Yata Y, Kawai K, Zhang W, Sugiyama T. Lipopolysaccharide triggered TNF-alpha-induced hepatocyte apoptosis in a murine non-alcoholic steatohepatitis model. J Hepatol, 2009, 51(1):168-175.

[3]Li JD, Peng Y, Li Q, Xiao JW, Gong JP, Liu ZJ. Potential protective effect of nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotides on endotoxin-induced liver injury. Transplant Proc, 2011, 43(10):3613-3617.

[4]Lefkowitz RJ, Shenoy SK. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science, 2005, 308(5721):512-517.

[5]Gao H, Sun Y, Wu Y, Luan B, Wang Y, Qu B, Pei G. Identification of beta-arrestin2 as a G protein-coupled receptor-stimulated regulator of NF-kappaB pathways. Mol Cell, 2004, 14(3):303-317.

[6]DeWire SM, Ahn S, Lefkowitz RJ, Shenoy SK. Beta-arrestins and cell signaling. Annu Rev Physiol, 2007, 69:483-510.

[7]何卉欣,蒋梦萍,刘慧玲,江洁,尉秀清.阻断TLR4信号通路对结肠癌细胞CT26裸鼠种植瘤生长和凋亡的影响.新医学,2015,46(4):216-220.

[8]Hoque R, Farooq A, Ghani A, Gorelick F, Mehal WZ. Lactate reduces liver and pancreatic injury in Toll-like receptor-and inflammasome-mediated inflammation via GPR81-mediated suppression of innate immunity. Gastroenterology, 2014, 146(7):1763-1774.

(本文编辑：杨江瑜)

Effect of β-arrestin2 in endotoxin-induced liver injury

JiangMengping,XuanJieying,XuChun,LuoQianjiang,WeiXiuqing.

DepartmentofGastroenterology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of the function of β-arrestin2 in the endotoxin-induced liver injury. MethodsEndotoxin-induced liver injury mouse models were established. Twenty β-arrestin2 knockout (KO) mice and twenty β-arrestin2 wild-type (WT) littermates were randomly divided into the experimental and control groups(n=10). In the experimental group, liver injury was induced by intraperitoneal injection of 5 mg/kg of lipopolysaccharide, and the control mice were administered with an equivalent quantity of normal saline. Six hours later, serum sampling and liver tissue were collected. The expression of β-arrestin2 in the mouse liver was measured by quantitative real-time PCR. The serum levels of ALT, AST and TNF-α were detected by ELISA. The expression of β-arrestin2, p-p65 and p-IкBα proteins was determined by Western blot. ResultsThe expression level of β-arrestin2 mRNA in the β-arrestin2 WT group was 0.18±0.06, significantly lower than 1.00±0.29 in the control group (t=-4.669, P<0.001). The expression of β-arrestin2 protein was also obviously down-regulated. In the β-arrestin2 KO group, the values of ALT and AST were (204.33±22.33)U/L and (403.40±53.45)U/L, significantly higher compared with (129.33±9.69)U/L and (256.20±40.47) in the β-arrestin2 WT group (t=7.55, P<0.001; t=6.94, P<0.001). The serum level of TNF-α in the β-arrestin2 KO group was (155.89±14.89) pg/L, significantly higher than (101.36±10.65) pg/L in the β-arrestin2 WT group (t=9.25，P<0.001). In the β-arrestin2 KO group, the expression of p-IкBα and p-p65 proteins within the mouse liver was significantly higher compared with that in the β-arrestin2 WT group. Conclusionβ-arrestin2 alleviates endotoxin-induced inflammatory response probably inhibiting the activation of NF-кB and reducing the production of TNF-α, which plays a protective role in endotoxin-induced liver injury.

【Key words】Endotoxin-induced liver injury; β-arrestin2; TLR4/NF-кB/TNF-α signaling pathway

(收稿日期：2015-11-06)

Corresponding author, Wei Xiuqing, E-mail: wei-xiuqing@163.com

通讯作者，尉秀清，E-mail: wei-xiuqing@163.com

基金项目：国家自然科学基金项目(81470848)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.005

·基础研究论著·