分子生物学技术在胃肠道微生物研究中的应用

汤文杰，唐　凌，张　纯，邝声耀*（四川省畜牧科学研究院动物营养研究所，四川省饲料科技研发中心，四川 成都 610066）

分子生物学技术在胃肠道微生物研究中的应用

汤文杰，唐凌，张纯，邝声耀*
（四川省畜牧科学研究院动物营养研究所，四川省饲料科技研发中心，四川 成都 610066）

摘要：本文论述了末端限制性片段长度多态性（T-RLFP）技术、变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术、荧光原位杂交（FISH）技术、实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术、基因芯片（Gene chip）技术及高通量测序（HTS）技术等多种分子生物学技术在胃肠道菌群研究方面的应用。

关键词：胃肠道微生物；末端限制性片段长度多态性；变性梯度凝胶电泳；荧光原位杂交；实时荧光定量PCR；基因芯片；高通量测序

近年来，随着分子生物学技术的成熟与发展，动物胃肠道微生物研究技术步入了一个新的阶段。现代分子生物学技术无论从质量上还是数量上都能更加精确地揭示微生物种类和遗传的多样性。本文就近年来国内外分子生物学技术在动物胃肠道微生物研究中的应用进展作一综述。

1　分子生物学研究方法

1.1末端限制性片段长度多态性（T-RLFP）技术T-RFLP技术以分子系统学原理为基础，综合运用了PCR、限制性酶切、荧光标记和DNA序列分析等技术，通过对特定核酸片段长度多态性的测定来分析微生物群落结构和功能。T-RFLP的原理：采用一端荧光标记的引物进行PCR，扩增全长16S rRNA基因，然后用合适的限制性内切酶消化PCR产物，产生不同长度特征的限制性片段。酶切后的产物用DNA测序仪进行分析，通过扫描得到含有荧光标记的片段，而没有标记荧光的片段无法识别，所以不能显示，最后通过分析，揭示样品种类、数量和种群大小等信息，从而解析群落结构、功能及动态变化。虽然该技术已被证明是一种监测胃肠道微生物群落的有用的指纹图谱技术，但是仍然存在局限性：（1）摆脱不了PCR技术共同的缺陷，如不同菌种DNA的差异性扩增，以及目标DNA在菌种间拷贝数的差异等；（2）T-RFLP图谱中每个TRF有可能不只对应一个菌种，造成对群落多样性的低估；（3）酶切后TRF的长度分布也会造成对复杂群落多样性的低估，因为测序仪检测500bp以上的TRF的精度不够；（4）实验过程影响因素众多，使得T-RFLP图谱的解析存在一定的不确定性；（5）在如何对大量T-RFLP数据进行处理和统计学分析，以挖掘出其中的群落结构信息方面，很多理论和技术上的问题仍处于摸索阶段。

1.2变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术DGGE技术的原理：碱基序列存在差异的不同等长DNA在同一含有变性剂的凝胶中进行电泳，会表现不同的电泳速度，因此通过对DNA染色可将不同的DNA区分开。DGGE技术一直不断的发展，随后出现了温度梯度凝胶电泳（TGGE）技术、瞬时温度梯度凝胶电泳（TTGE）技术等，DGGE及其相关技术已被应用到人类、猪、牛、狗和啮齿动物等物种的微生物生态系统研究上，揭示了动物年龄、日粮成分、益生菌以及抗生素对肠道细菌群体的影响。DGGE作为一种分子生物学技术，除拥有多数分子生物学技术所共有的缺点外（即PCR过程中会产生偏差），还有一些自身的缺陷：（1）DGGE只能分离1 000 bp以下的DNA片段，只能够提供有限的系统发育信息；（2）如果实验条件不恰当，梯度不合适，会使序列不同的DNA迁移到胶的同一位置；（3）PCR-DGGE的指纹图谱上通常仅显示微生物群落中的优势种群，所以只能对菌体数量大于总菌量1%的菌群进行分析。虽然DGGE技术存在不少缺点，但它可直接利用DNA或者RNA对微生物遗传特征进行表征，不但避免了传统上耗时的菌种分离，直接再现微生物群落的遗传多样性和动态性，更可与16S rDNA基因序列分析结合，鉴定出无法利用传统方法分离的菌种，因而成为胃肠道微生物研究的新宠。

1.3荧光原位杂交（FISH）技术FISH技术的原理：根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，从而检测该特异微生物种群的存在与丰度。FISH相对其他技术的优点是无需培养和核酸提取、PCR扩增等程序，能够定量和自动化，可以描述微生物的形态特征、丰度以及在样品上的空间分布和动态。目前，研究者已经设计出许多不同细菌的特异性探针。应用此技术，一组15个的FISH探针就能够检测到约90%的人类常规肠道微生物。实际上，FISH技术仍然存在一些不足：（1）从研究对象来看，FISH技术只能面向已知序列的微生物进行研究；（2）细菌普遍存在自发荧光现象且灵敏度较低，容易导致假阳性结果。所以，FISH技术还需要与其他分子生物学技术结合使用，才能达到更好的效果。

1.4实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术RT-PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光物质，通过RTPCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。由于该方法高效、准确的定量特性，目前已成功用于对人类、仔猪肠道及反刍动物瘤胃中某些特定菌群的定量分析。RT-PCR技术延续和发展了普通PCR的敏感性和特异性，同时克服了普通PCR不能精确定量、容易污染的不足。当然，RT-PCR尚存在一些不足之处：（1）荧光素种类及检测光源的局限性会不同程度地限制RT-PCR的复合式检测应用能力；（2）该技术只能对少数目标种类进行测定，对于研究复杂的生态系统，此技术便非常费时费力，因为每种细菌都需要特定的引物与PCR扩增条件。目前，在猪的肠道微生物研究方面，研究者已经设计了各种引物能够对总细菌、乳酸菌、链球菌和双歧杆菌等进行定量检测。所以，用该技术对肠道菌群进行研究时，还需要与其他分子生物学技术相结合，从而定性、定量地研究微生物区系的变化，深入了解微生物菌群与环境之间的相互作用及其动态变化过程，为全面、快速、准确分析和鉴定复杂环境中的微生物菌群提供了一种新的技术手段。

1.5基因芯片（Gene chip）技术Gene chip技术是采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量DNA探针如基因、PCR产物和人工合成的寡核苷酸等有序地固定在载体表面，形成储存大量信息的高密度DNA微阵列，该微阵列与标记的核酸样品杂交后，能快速、准确、大规模地获取样品核酸序列信息，从而应用于各种生态系统的菌群研究。Wang等较早建立了人胃肠道40种主要细菌的芯片鉴定技术，包括拟杆菌、梭菌属、瘤胃球菌、真杆菌、梭形杆菌、乳酸杆菌、球杆菌、大肠杆菌等，发现其中33种细菌都能通过此方法检测到。在研究人类结肠和胃微生物生态系统时，所设计芯片中的探针能检测到359个微生物物种和316个新的OTUs。最近由Oleg等制备出的基因芯片则更为灵敏，可检测出人类肠道中775个微生物物种。近年来，这项技术正广泛应用于病原微生物的检测研究。当然，基因芯片技术研究体系仍然存在一定的提升空间，比如提高芯片的特异性、增加信号检测的灵敏度，这些都可以为肠道菌群的研究提供更为广阔的应用前景，从而推动该领域研究达到一个新的高度。

1.6高通量测序（HTS）技术HTS技术的原理：在焦磷酸测序的反应体系中会存在4种酶，分别为DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶，反应底物为5′-磷酰硫酸以及荧光素，在反应体系中还包括待测序DNA单链和测序引物。当引物与模板DNA复性后，在上述4种酶的协同作用下，每一个dNTP的聚合会与一次荧光信号的释放偶联起来，最终以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷酸序列。随着HTS技术的发展，宏基因组技术开始被用于研究人类及动物胃肠道微生物群落的结构和功能。2006年，Gill等首次对两个健康人的微生物宏基因组进行了比较，并提出了“Superorganism”概念。Ziemer取猪粪便，加纤维素、果胶木聚糖连续培养8周后，利用基于高通量测序的宏基因组技术得到575种细菌菌株，与核糖体数据库比对后，约有30%的细菌为不可培养菌，有179株属于新的菌种或菌属。通过高通量测序技术对动物肠道微生物进行测序，然后比对数据库，可准确获得肠道微生物群落的分类、丰度信息，确定这些肠道微生物的主要功能，为后续动物肠道研究提供支持。

虽然高通量测序技术相对于传统研究方法而言在获得微生物数据量、可操作性等方面具有很大进步，但仍不够完善。比如，现在的高通量测序技术都是将DNA剪切为小片段后，再单个连接至一定的固相表面单独扩增后拼接并检测信号，DNA拼接越长难度越大，因而难以完全控制完美的片段阈值，存在一定的误差。另一方面，高通量测序越来越强的测序深度及越来越大的数据输出也导致现有算法难以完全利用如此庞大的数据量，不但造成数据的浪费且在一定程度上制约了高通量测序技术在宏基因组学方面的应用。此外，该方法的费用非常高。不可否认，高通量测序技术第一次使人类得以研究占环境中99%的不可培养的微生物种群，进一步拓展了人类研究肠道菌群的深度和广度，但该方法的费用不菲，不利于广泛推广。

2　分子生物学方法存在的问题

分子生物学方法较传统方法有不可替代的优势，但也存在着许多问题：

2.1样品保存问题环境样品在提取核酸前的厌氧和常温存放不可避免地导致样品中微生物发生变化，冷冻可以减缓变化过程，但是存放时间也不可以过长，某些微生物在0～4℃仍然可以观测到明显的生长现象。

2.2样品DNA的质量问题一般粪便样品中除肠道微生物外，还有腐殖质、动物肠道脱落细胞及碎片、各种无机物和有机物等，如何获取高质量、较完整的肠道菌群基因组DNA是肠道微生物研究的基础。

2.3DNA纯化问题微生物与环境中的有机物结合紧密，对高效率提取核酸造成了困难；样品中存在的腐殖酸对DNA的检测和定量也有很大的影响，主要表现在抑制DNA高温聚合酶的活性，干扰限制酶的结合位点，降低转化效率以及DNA杂交的特异性。

3　小结

分子生物学方法可以让我们更深入地了解肠道微生物群落的结构、多样性和功能等，由于每种研究微生物的技术都有一定的优势和局限性，故实际研究过程中经常采取多种方法相结合的手段。■

参考文献：

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中图分类号：S818.9

文献标识码：A

文章编号：1001-8964（2016）06-0027-03

收稿日期：2016-02-24

基金项目：四川省公益性科研院所基本科研业务费项目（SASA2013A05）

作者简介：汤文杰（1984-），男，四川南充人，硕士研究生，主要从事动物营养研究与饲料添加剂开发。

*通讯作者：邝声耀，研究员。

Application of Molecular Biological Technology in the Study of Gastrointestinal Microflora

TANG Wenjie，TANG Ling，ZHANG Chun，et al.
（Institute of Animal Nutrition，Sichuan Animal Science Academy，Sichuan Feed Scientific Research and Development Center，Sichuan Chengdu 610066，China）

Abstract：This paper focused on the application of some modern molecular biotechnology in the study of gastrointestinal microorganism，including terminal-restriction fragment length polymorphism（T-RFLP），denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE），fluorescence in situ hybridization（FISH），real-time polymerase chain reaction（RT-PCR），gene chip and high-throughput sequencing（HTS）technology etc.

Key Words：Gastrointestinal microflora；T-RLFP；DGGE；FISH；RT-PCR；Gene chip；HTS