小檗碱对人前列腺癌细胞株PC3增殖、凋亡的影响及其机制

钟静，刘杉，杨应，魏晶，黄晶晶，熊校勤

(湖北第二师范学院植物抗癌活性物质提纯与应用湖北省重点实验室，武汉430205)



小檗碱对人前列腺癌细胞株PC3增殖、凋亡的影响及其机制

钟静，刘杉，杨应，魏晶，黄晶晶，熊校勤

(湖北第二师范学院植物抗癌活性物质提纯与应用湖北省重点实验室，武汉430205)

目的观察小檗碱对人前列腺癌细胞株PC3增殖、凋亡的影响，并探讨其可能作用机制。方法取对数生长期PC3细胞分为A、B、C、D、E组，分别加入终浓度为10、25、50、75、100 μmol/L小檗碱培养，对照组只加ddH2O。观察培养24、48 h时各组细胞增殖情况。另取培养48 h时PC3细胞(观察组)，加入终浓度为 75 μmol/L小檗碱培养，对照组只加细胞培养液，观察细胞凋亡情况，检测剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)。结果随浓度升高，A、B、C、D、E组细胞增殖抑制率增加，P均<0.05；随培养时间增加，A、B、C、D、E组细胞增殖抑制率增加，P均<0.05。培养48 h时观察组及对照组细胞凋亡率分别为74.43%±5.69%、2.51%±0.86%，观察组细胞凋亡率与对照组比较明显升高(P<0.05)。培养48 h时观察组细胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白的相对表达量分别为0.30±0.02、0.56±0.03、0.37±0.03、0.10±0.01,对照组分别为0.15±0.04、0.41±0.03、0.58±0.04、0.11±0.02。与对照组相比，观察组细胞Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白的相对表达量均升高，Bcl-2蛋白的相对表达量降低(P均<0.05)，而LC3蛋白的相对表达量无明显变化。 结论小檗碱可抑制PC3细胞增殖、促进细胞凋亡，其机制可能与小檗碱可上调Cleaved-Caspase-3、Bax表达，抑制Bcl-2表达有关。

小檗碱；前列腺癌；细胞增殖；细胞凋亡；自噬

前列腺癌是中、老年男性常见的泌尿系统恶性肿瘤[1]。其发病率和病死率分别居全球男性癌症的第2位和第6位，且呈逐年递增趋势[2]。前列腺癌的发病机制目前尚不明确，既往研究[3]认为细胞增殖和凋亡的失衡是其发生、发展的重要因素。凋亡和自噬是细胞死亡的两种形式。两者机制不同，但是存在复杂的交互调控作用。B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)是调控细胞凋亡的关键因素，前者具有抑制凋亡作用，而后者具有促进凋亡作用[4]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)在细胞凋亡过程中关键的凋亡执行分子，参与许多凋亡信号传导途径[5,6]。而微管相关蛋白1轻链3(LC3)则是重要的检测自噬体形成的特异性标记蛋白[7,8]。小檗碱是一种喹啉生物碱，主要存在于毛莨科、芸香科和小檗科等植物中[9]；因具有清热解毒和抗菌消炎的功效，传统中医中长期用于治疗细菌导致的胃肠道疾病[10,11]。最新研究发现，小檗碱可提高糖尿病患者的胰岛素抵抗、改善高血脂[12,13]。同时其抗肿瘤活性较高，但其抗肿瘤的具体作用机制及其通道尚未完全阐明[14～16]。2014年4月～2015年12月，我们观察了小檗碱对人前列腺癌细胞株PC3增殖及凋亡的影响，并探讨其可能机制。现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1细胞、药物、仪器及试剂PC3细胞购自中国典型培养物保藏中心，置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，37 ℃、5% CO2条件下培养。细胞贴壁生长，0.25%胰蛋白酶消化传代。小檗碱、MTT购自Sigma公司。DMEM培养基及胎牛血清购于Gibco公司,细胞裂解液来自碧云天生物技术研究所,GAPDH、Bcl-2、Bax、剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)、LC3抗体购自CST公司。蛋白电泳仪和半干转膜仪购自Bio-RAD公司。

1.2小檗碱对PC3细胞增殖的影响观察采用MTT法。取对数生长期PC3细胞，3×103/孔接种于96孔板，分为A、B、C、D、E组，分别加入终浓度为10、25、50、75、100 μmol/L小檗碱培养，对照组只加ddH2O。分别于培养24、48 h时取各组细胞，加入5 mg/mL MTT 10 μL，孵育4 h，离心后取上清，加入150 μL DMSO，轻微振荡 10 min，使结晶物充分溶解，采用酶标仪检测各组在570 nm 波长处的吸光度(A)，计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-A实验组/A对照组)×100%。重复3次，取平均值。

1.3小檗碱对PC3细胞凋亡的影响观察及细胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3检测①小檗碱对PC3细胞凋亡的影响观察：采用流式细胞仪。取对数生长期观察组细胞，1×106/mL接种于96孔培养板中，加入终浓度为75 μmol/L的小檗碱培养，每组5个复孔，对照组只加培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h。各取100 μL两组细胞悬液，加入5 μL Alexa Fluor@488 annexin V和100 μg/mL PI 1 μL，混匀后室温避光孵育15 min。采用流式细胞仪检测两组培养48 h时细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。②细胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白检测：采用Western blotting法。培养48 h时取两组对数生长期细胞，胰蛋白酶消化，PBS洗两次，加入150 μL细胞裂解液混匀，冰上放置30 min使细胞充分裂解，获取上清液。BCA法提取总蛋白，取30 μg总蛋白，12% SDS-PAGE电泳90 min，半干转膜仪转膜40 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗膜，加入兔抗大鼠Bax和Bcl-2一抗(1∶1 000)、兔抗大鼠Cleaved-Caspase-3一抗(1∶500)、兔抗大鼠LC3一抗(1∶500)4 ℃过夜。TBST洗膜4次，每次5 min；加入山羊抗兔Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3和LC3二抗(1∶2 000)封闭1 h，显色曝光。以GAPDH作为内参，用Image J软件进行灰度扫描进行定量分析。以目的蛋白与GAPDH灰度值之比作为Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2　结果

2.1不同时间点各组细胞增殖抑制率比较培养24 h时A、B、C、D、E组的细胞增殖抑制率分别为0.69%±0.22%、14.19%±1.38%、32.15%±2.63%、38.87%±1.09%、44.27%±1.95%，随浓度升高，A、B、C、D、E组细胞增殖抑制率增加，P均<0.05。培养48 h时A、B、C、D、E组的细胞增殖抑制率分别为6.60%±3.80%、20.23%±7.62%、38.12%±1.66%、46.35%±1.56%、63.36%±2.06%，随培养时间增加，A、B、C、D、E组细胞增殖抑制率增加，P均<0.05。

2.2两组细胞凋亡率及细胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白比较培养48 h时观察组及对照组细胞凋亡率分别为74.43%±5.69%、2.51%±0.86%，观察组细胞凋亡率高于对照组(P<0.05)。培养48 h时观察组细胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白的相对表达量分别为0.30±0.02、0.56±0.03、0.37±0.03、0.10±0.01,对照组分别为0.15±0.04、0.41±0.03、0.58±0.04、0.11±0.02，与对照组相比，观察组组细胞Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白的相对表达量升高，Bcl-2蛋白的相对表达量减低，而LC3蛋白的相对表达量无明显变化(P均<0.05)。

3　讨论

前列腺癌是发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，其发生与多种因素有关。在直系男性亲属患前列腺癌的家族中，其男性发病率明显增高。雄激素可以促进前列腺癌的生长，体内雄激素水平较高可能也是前列腺癌的诱因之一。此外，高动物脂肪饮食也与前列腺癌的发生有一定关系[1]。对前列腺癌的治疗方法包括放射性粒子植入、根治性前列腺切除术、根治性外放射治疗、内分泌治疗和免疫治疗等[2]。目前在癌症治疗中普遍采用的药物在杀死癌细胞的同时也会对人体正常细胞产生较大毒副作用。因此，疗效好且毒性低的抗癌药物研究一直是癌症治疗研究领域的热点和重要课题。其中，植物来源抗癌药物的研究和开发是其重要组成部分。

以往我国临床常用小檗碱治疗胃肠道感染，近年研究[9,10，12，13]表明小檗碱能通过改善肠道菌群结构、加强肠道黏膜屏障和改善局部的慢性炎症从而起到抗代谢紊乱的作用。此外小檗碱在肠道肿瘤防治中也表现出良好的效果。例如小檗碱可以减少宫颈癌细胞的转移和血管生成[14]。在肝癌细胞中，小檗碱能够通过下调血管内皮生长因子，从而抑制癌细胞血管生成，最终导致细胞死亡[15]。小檗碱可通过引起结肠癌细胞周期阻滞在G2/M期并诱导p21，从而引起细胞凋亡[16]。尽管目前对小檗碱抗癌的作用机制已经有了一定的研究，但是其具体途径和机制尚未完全明确，尤其小檗碱在发挥抗癌作用中是否涉及细胞自噬过程并不清楚。因此，本研究观察研究了不同浓度小檗碱对PC3前列腺癌细胞增殖的影响和可能机制。结果显示，小檗碱对PC3前列腺癌细胞增殖具有明显的抑制作用，且这种抑制作用具有浓度和时间依赖效应。

细胞凋亡是细胞死亡的一种形式[17]。Bcl-2家族在线粒体依赖的细胞凋亡途径中起着重要的调控作用。该家族成员包括Bcl-2/Bax、Bcl-xl/Bcl-xs和Bak等，其中Bcl-2/Bax的作用尤为关键[4]。Bcl-2是一种抑制凋亡蛋白。Bcl-2可与Bax形成异源二聚体使其失活，并改变线粒体膜的通透性，促使细胞色素C的释放。细胞色素C与Apaf-l和Caspase-9形成复合体，激活凋亡效应分子Caspase-3，最终引起细胞凋亡[5,6]。本研究结果显示用75 μmol/L小檗碱处理PC3细胞48 h能够引起PC3细胞产生显著的凋亡现象。进一步的研究显示，处理细胞中Bcl-2表达水平明显下降，而Bax和Cleaved-Caspase-3表达量则明显上调。这可能是由于小檗碱处理条件下，由于Bcl-2的下调和Bax的上调，导致细胞内Bax/Bax同源二聚体增多。进而调控线粒体PT孔的开放，释放出细胞色素C。细胞色素C、Apaf-l和Caspase-9复合体剪切Caspase-3前体形成具有活性的Cleaved-Caspase-3，从而激活Caspase级联反应促进细胞凋亡。

目前研究认为，自噬是区别于凋亡的另一条细胞死亡途径。自噬和凋亡二者通路相互关联，互为调控[18]。Bcl-2家族蛋白除参与到细胞凋亡之外还可对细胞自噬过程产生调节作用。Beclin1参与了自噬体的形成和成熟。Bcl-2能与Beclin1结合，从而抑制自噬的发生[19]。LC3是评价自噬活性的重要标记分子，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式。当形成自噬体时，LC3-Ⅰ与自噬体膜上的磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ。直到自噬体与溶酶体结合后，LC3-Ⅱ才被其中的水解酶降解[7,8]。为了解本研究中Bcl-2表达量的下降是否会引起细胞自噬，因此进一步检测了LC3的表达情况。结果显示，在用小檗碱处理PC3细胞后，细胞中LC3表达量并无明显变化，这表明小檗碱处理并没有促进细胞内自噬体的形成。这可能是由于尽管细胞内Bcl-2表达水平有所下降，释放出Beclin1。但是由于Caspase-3的激活，能够剪切Beclin1从而抑制自噬的发生，因此无法促进自噬体的形成。

综上所述，小檗碱能够明显抑制前列腺癌PC3细胞的增殖。其作用机制可能是通过下调Bcl-2的表达，上调Bax和Cleaved-Caspase-3的表达，从而激活线粒体依赖的细胞凋亡途径。并且其中可能并不涉及自噬途径。

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Trans助研梦想基金项目(Trans-RasDF-019)。

熊校勤(E-mail：jjing2003_1@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.013

R737.25

A

1002-266X(2016)27-0041-03

2016-02-19)