睾丸间质干细胞分化和移植

徐文丹，崔毓桂

(南京医科大学第一附属医院生殖医学中心，南京　210029)



·综述·

睾丸间质干细胞分化和移植

徐文丹，崔毓桂*

(南京医科大学第一附属医院生殖医学中心，南京210029)

【摘要】睾丸间质细胞是男性体内合成雄激素的主要细胞，胚胎发育期中肾胚的间质细胞及生精小管周成纤维样细胞可能是睾丸间质细胞的干细胞。在胚胎期间质干细胞分化为胎儿型间质细胞；出生后间质干细胞经间质祖细胞、未成熟间质细胞分化为成熟间质细胞。老年期间质细胞数量可能不变，但雄激素合成下降。间充质干细胞及脂肪干细胞等干细胞经诱导可分化为分泌雄激素的睾丸间质细胞，因此，间质干细胞移植可望成为治疗男性性腺功能不全和中老年雄激素缺乏的创新方法，本文对睾丸间质干细胞的分化及移植方面研究进行综述。

【关键词】间质细胞；间质干细胞；雄激素；干细胞移植

(JReprodMed2016，25(4)：369-373)

睾丸间质细胞(LCs)是男性合成雄激素的主要细胞[1]，1850年Franz Leydig鉴定并命名。哺乳动物发育过程中会出现两种间质细胞：胎儿型间质细胞(FLCs)和成熟型间质细胞(ALCs)[2]。目前已分离鉴定啮齿类动物睾丸间质干细胞(Stem Leydig cell，SLCs)为胚胎发育期的中肾胚的间质细胞及睾丸小管周成纤维样细胞(也称作间充质干细胞)，胚胎期中肾胚的间质干细胞分化为可分泌雄激素的FLCs。出生后成熟型间质细胞产生分为4步：由睾丸局部的小管周成纤维样细胞经间质细胞祖细胞(Progenitor leydig cells，PLCs)、未成熟型间质细胞(ILCs)最终分化为ALCs[3]，人也类似[4]。到了老年期或迟发性性腺功能减退症即LOH，睾丸间质细胞数量可能不变、但功能逐渐下降，而间质干细胞还存在[5]。目前临床普遍采用睾酮补充疗法(TST)来缓解老年人及迟发性性腺功能减退症引起的骨质疏松、性欲下降等症状。现多文献报道间质干细胞的移植可恢复雄激素水平，且可接收到躯体信息的反馈，更符合生理需求，故有望成为治疗雄激素缺乏相关疾病的方法[6]。本文将对睾丸间质细胞的分化及间质干细胞移植治疗方面进行综述。

一、睾丸间质干细胞的起源

有报道称体腔上皮细胞可分化为支持细胞及非支持细胞(含间质细胞)，但是间质细胞并没明确的鉴定出来[7]。FLCs的来源目前并不清楚，推测其前体可能同为内分泌及类固醇生成细胞的干细胞。因此神经脊细胞、肾上腺干细胞可能是FLCs干细胞，将它们移植至睾丸间质最终可分化为FLCs，但是应用基因敲除小鼠技术证实，它们并不是胎儿型间质干细胞[8]。还有报道是中肾组织迁入到性腺中形成间质细胞但是随后鉴定移入的间质干细胞也未分化为胎儿型间质细胞[9]。2011年学者用分子标志法发现体腔上皮及性腺和中肾的交界处细胞为FLCs的干细胞来源[10]。

Kilcoyne等报道经二甲磺酸乙烷(EDS)诱导睾丸间质细胞凋亡后再生证实青春期睾丸间质干细胞是生殖小管周围的细胞，这些细胞可表达鸡卵清蛋白上游启动子转录因子(COUP-TF)[11]，但并未证明这些细胞是否全是间质干细胞或只是一部分可分化为成熟型间质细胞，也并未说明这些细胞是否由管周的细胞去分化而来。2014年Odeh的实验也证实这一ALCs干细胞来源[12]。

二、胎儿型睾丸间质细胞

1. SLCs向FLCs分化：1904年首次在猪胚胎中发现FLCs[13]。在大鼠妊娠期第12 d，来自胚胎生殖嵴的干细胞开始分化成FLCs。而小鼠在胚胎12.5～13.5 d(E12.5～13.5)于睾丸间质中出现FLCs，间质细胞处于祖细胞状态，分子标记为SF-1(类固醇生成因子)ˉ/3β-HSDˉ(3β-类固醇脱氢酶)。E13.5即在支持细胞出现一天后分子标记为SF-1+/3β-HSDˉ的细胞出现，最终于E16.5形成分子标记为SF+/3β-HSD+的FLCs[14]。在出生后睾丸间质中FLCs得以保留，但很快退化，虽然对FLCs是否最终死亡不甚明确，但对于出生后雄激素的分泌，这些细胞的作用可以忽略不计[15]。

2. FLCs分化的调节因素：FLCs分化过程主要受到支持细胞旁分泌因子的调控。其中缺刻因子(NOTCH)是调节细胞间作用的跨膜受体，参与FLCs细胞的产生与维持[16]，使用抑制剂或失活NOTCH下游受体发现FLCs细胞增多而持续活化此信号通路FLCs减少，故其是通过与膜配体及下游受体相互作用发挥作用的[17]；另一因子通路——刺猬因子(Hh)信号通路是调节多细胞动物正常生长及细胞增殖的主要通路，此通路活化后胎儿期干细胞变少，干细胞向FLCs细胞分化增多[14]。

构建超表达支持细胞雄激素受体(SCAR)的小鼠模型，发现支持细胞和精子过早成熟，同时也证实SCAR可促进间质细胞(包括FLCs及ALCs)的分化，但是间质细胞数量却下降，分泌的雄激素反而增多，原因目前不清楚[18]。

三、成熟型睾丸间质细胞

1.ALCs的分化：ALCs并不来源于FLCs，且ALCs和FLCs是否由同一种细胞分化而来并不明确。但有研究报道表明ALCs与FLCs都可来源于胎儿期的SF1+细胞，且管周细胞为ALCs的干细胞[19]。间质干细胞在生精小管周围而非睾丸间质中，其可增殖并在黄体生成素(LH)及胰岛素样因子1(IGF-1)的诱导下分化为产睾酮的间质细胞[20]。

2.ALCs分化的影响因素

(1)成纤维细胞生长因子(FGF)：培养大鼠生精管并用EDS诱导间质细胞再生方法研究FGF对间质干细胞的增殖及分化的影响，发现低浓度FGF可促进SLCs的增殖及随后的分化，也可通过增多类固醇激素生成快速调节因子(STAR)、类固醇侧链裂解酶(CYP11A1)、3β-HSD表达促进ALCsILCs睾酮的生成但在PLCs抑制这些酶的表达减少雄激素的产生。而高浓度的FGF作用相反，并指出FGF可能通过影响五种微小RNA(microRNAs) (miR-29a，-29c，-142-3p，-451和-335) 来调节雄激素的合成[21]。

(2)威廉姆肿瘤因子1(WT1)：WT1是编码4个左右锌指结构，可以抑制肿瘤生长的转录因子，在睾丸中主要由支持细胞产生。有研究者特异性敲除支持细胞的WT1，发现出生后1～56 d(Postnatal1～56，P1～56) FLCs可保持其有丝分裂活性，且这些细胞表达的基因类型与FLCs有所不同，称为胎儿样间质细胞。P56青春期后WT1可促进FLCs的正常退化而促进ALCs的分化[11]，其作用机制可能为抑制WT1可下调影响间质细胞分化的沙漠刺猬因子(Dhh)及血小板源性生长因子(PDGF-α)[22]。

(3)胰岛素样因子(IGF-1)：IGF-1可促进PLCs、ILCs的增殖，IGF-1基因敲除后小鼠的间质细胞减少。这可能因为敲除IGF-1的小鼠的支持细胞功能下降，分泌的生长因子减少导致PLCs、ILCs减少，而并不影响SLCs的增殖[23]。

(4)LH和卵泡生成素(FSH)：使用LH抑制剂后PLCs减少，而再加入LH后PLCs可恢复，在体外LH可促进PLCs分化，可增加PLCs增殖因子的表达[24]。另一报道[25]也证实了LH对间质细胞的促分化增殖作用。2014年Verhagen等[26]证实恒猿猴间质细胞的增殖分化也受到LH的刺激作用，另外也发现FSH的刺激作用但不如LH的作用效果。

四、老年期间质细胞

老年期间质细胞合成雄激素的功能逐渐下降，类固醇合成酶CYP11A、3β-HSD和 17β-HSD表达下降，目前机制不明确，但间质细胞数量并不变，SLCs也并不随着年老而衰减[6]。有报道雄激素受体敲除小鼠的间质细胞凋亡增多并提前出现，可能因为雌激素信号通路变强所致，表明自身分泌的雄激素可防止间质细胞过早凋亡。雄激素减少会引起性欲下降、晨勃减少和勃起功能障碍，即LOH，2%的40～80岁的人群会发生LOH[27]。

五、SLCs移植

1. 胚胎干细胞(ESCs)的移植：研究表明过表达SF-1、8-溴-环磷腺苷(8-Br-cAMP)和毛喉素(FSK)共同作用都可增加ESC向ALC分化效率，将ESCs及过表达SF-1的ESCs转移至EDS消除原有间质细胞的大鼠睾丸中，发现其可定位于睾丸间质中并完全分化为成熟的间质细胞，过表达SF-1的ESCs在EDS处理后14天可使下降的血清睾酮值恢复原值。但这项研究并没阐明ESCs诱导向间质样细胞分化的机制，也没有排除ALCs为大鼠本身间质祖细胞分化而来或间质细胞与间质样细胞的融合的可能，而且这样移植长远的安全性也需要进一步研究[28]。

2. 间质细胞干细胞移植：将睾丸间质中表达细胞标志物CD51的SLCs打入EDS处理后或年老的的小鼠或大鼠后可定位于睾丸间质中，并分化为成熟的间质细胞，生成的睾酮增加且生精能力也增加[29]。

异位移植睾丸后精子存在，支持细胞也存在，间质细胞可再生，能作为治疗不育症及雄激素低下疾病的一种方法[30]。

3. 骨髓间充质干细胞(MSCs)移植：MSCs是存在于成体的骨髓中，属于成体干细胞。2006年报道大鼠的MSCs移植到未成熟大鼠睾丸后，其只定位于睾丸间质中并表达STAR、CYP11A1、3β-HSD与正常间质细胞无区别。体外实验也发现在SF-1及cAMP诱导刺激下可分化为间质细胞，但是人的MSCs在上述诱导刺激下却分化为分泌糖皮质激素的肾上腺细胞，这可能是因为MSCs有种族异质性导致的。肝受体类似物(LHR-1)与SF-1属于孤核受体超家族，加入LHR-1可增强MSCs的分化率[31]。

4. 诱导性多功能干细胞(IPS)：IPS细胞是将已分化成熟体细胞重编程为类似于胚胎干样细胞(ESCs)。除成纤维细胞可诱导为IPS外，现角质细胞、神经干细胞、内皮细胞、干细胞等也已用于IPS的诱导。IPS重编码方法很多主要分为病毒依赖型及非病毒依赖型。向小鼠及人的皮肤细胞中转染八聚体结合转录因子3/4(Oct3/4)、SRY相关的高迁移率组(HMG)盒蛋白(Sox2)、Kruppel样因子(Klf4)和原癌基因(c-Myc)4个转绿因子外又添加一种蛋白小鼠-β-防卫肽-3(Mbd3)，使得重编码率达到100%[32]。IPS细胞在生长特性、表面形态、特殊标志物及增殖及分化潜能方面类似于胚胎干细胞，并且IPS细胞来源较广泛，可由健康或是病人的任何器官的成体细胞重编码生成，避免了患者异体干细胞移植引起的免疫排斥反应，也无需再担心伦理问题等，但是依然有致癌性。目前大量研究者在药物监测、疾病细胞模型建立，疾病的细胞治疗上用IPS，但很遗憾，现在在IPS分化为间质细胞这一方面还无研究。只有一IPS向肾上腺细胞分化的报道[33]。

5. 脂肪干细胞(ADSCs)：ADSCs来源于脂肪，具有多分化潜能，可分化为不同细胞，也可以促进血管生成，可能与脂肪干细胞分泌多种细胞因子有关，其中脂肪干细胞分泌的生长因子不仅可促进自身转移到受伤组织，还可以促进其他干细胞的增殖及分化，故可抗细胞组织损伤，又因其致癌风险低，数量足，用其治疗泌尿道及男科疾病成为可能[34]。2015年国内学者将ADSCs静脉注入D-半乳糖诱导的致衰老小鼠，发现此小鼠内血清睾酮水平可上升，推测ADSCs可能分化为间质细胞[35]。

六、结论

间质细胞在胚胎期及出生后分化过程及具体作用都不同，但都是分泌雄激素发挥作用。目前FLCs及ALCs的干细胞并没有明确来源，其增殖及分泌雄激素的过程受到内分泌和局部因子的调节。另外，发现间质细胞缺失或受损导致雄激素分泌减少时，除使用雄激素补充雄激素还可以尝试采用间质干细胞移植方法间接补充雄激素，目前ESCs、IPS、ADSCs等干细胞都可用于移植诱导为间质干细胞，但都仅限于动物实验，还未有间质干细胞移植用于人体疾病。相信不久的未来就会出现间质干细胞移植应用于临床，治疗雄激素减少的相关疾病。

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[编辑：辛玲]

Differentiation and transplantation of testicular Leydig stem cell

XUWen-dan，CUIYu-gui*

ClinicalCenterofReproductiveMedicine,FirstAffiliatedHospital,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029

【Abstract】

Testicular Leydig cells are main cells which synthesize testosterone in male. Mesonephric stromal cells and fibroblast-like cells around seminiferous tubules are the stem Leydig cells (SLCs) during fetal development. In mammalian, the fetal Leydig cells (FLCs) are differentiated from SLCs at fetal stage. The neonate SLCs differentiated to the adult Leydig cells (ALCs) via progenitor Leydig cells (PLCs), immature Leydig cells (ILCs). Testosterone production in Leydig cells decreases along with aging, while total number of Leydig cell may not changed. It was reported that marrow stromal cells (MSCs) and adipose-derived stem cells, as well as some other stem cells, could beinvitroinduced to differentiate to SLC with the function of testosterone production. SLCs transplantation could be a new method for clinical treatment of male hypogonadism and andropouse. The differentiation of SLCs and transplantation are reviewed in this paper.

【Keywords】Leydig cell; Stem Leydig cell;Androgen;Stem cell transplantation

【作者简介】徐文丹，女，山东枣庄人，硕士研究生，生殖医学专业.(*通讯作者,Email：cuiygnj@njmu.edu.cn)

【基金项目】国家自然科学基金(81170559，81370754)；江苏省卫生厅科教兴卫工程(ZX201110)

【收稿日期】2015-06-25；【修回日期】2015-08-06

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.04.016