高效液相色谱-串联质谱法同时测定农田土壤中的六溴环十二烷和四溴双酚A

王晓春,陶 静,李铁纯

(1.鞍山师范学院 化学与生命科学学院，辽宁 鞍山 114016;2.国家地质实验测试中心，北京 100037)

高效液相色谱-串联质谱法同时测定农田土壤中的六溴环十二烷和四溴双酚A

王晓春1,2*,陶 静1,李铁纯1

(1.鞍山师范学院 化学与生命科学学院，辽宁 鞍山 114016;2.国家地质实验测试中心，北京 100037)

建立了加速溶剂萃取/高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(ASE/HPLC-MS/MS)批量检测农田土壤中六溴环十二烷(HBCDs)和四溴双酚A(TBBPA)残留的分析方法。土壤样品经加速溶剂萃取，Sep-pak C18固相萃取柱净化后，在多反应监测(MRM)负离子电喷雾模式下进行HPLC-MS/MS分析。色谱柱为X Bridge C18反相柱(150 mm × 2.1 mm × 3.5 μm)，流动相为梯度变化的甲醇和水溶液。在最佳实验条件下,六溴环十二烷和四溴双酚A在0.50～200.0 μg/L范围内线性关系良好(r≥0.998)，方法检出限(S/N≥3)为1.80～10.0 ng/kg。在1.0～40.0 μg/kg 添加水平内，平均加标回收率为73.8%～106.9%，相对标准偏差(RSD)为5.8%～11.2%。采用该方法分析了我国某区域内表层土壤样品的HBCDs和TBBPA，得到理想的分析效果。

加速溶剂萃取；高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)；农田土壤；六溴环十二烷(HBCDs)；四溴双酚A

六溴环十二烷(C12H18Br6，简称HBCDs)是一种高溴含量的脂环族添加型溴代阻燃剂，可按照一定比例添加在发泡聚苯乙烯、聚丙烯以及其它苯乙烯树脂和不饱和聚酯树脂中，在电器、针织物、粘合剂和涂料等领域应用较广泛，具有用量低、阻燃效果好、对材料物理性能影响小等特点。在阻燃剂产品中，HBCDs的使用量仅次于十溴联苯醚和四溴双酚A(TBBPA)[1-3]。商品化的HBCDs 由3 种非对映异构体(α，β，γ-HBCD)组成，其中γ-HBCD在混合物中所占比例最大(约占78%)[4]。HBCDs在自然环境中相当稳定，不易被降解，能够在环境中长期积累、迁移和转化，具有一定的慢性或亚毒性，可导致老鼠肝脏增重、甲状腺增大等，已被列入“斯德哥尔摩公约”优先控制POPs候补名单。随着高效阻燃剂多溴联苯醚(PBDEs)在全球的禁用，HBCDs作为PBDEs的替代品，其造成的环境污染问题日益引起各国的关注。TBBPA是目前产量和使用量最大的溴阻燃剂[5]，主要应用于电子电气产品、印刷线路板层压板、树脂和塑料生产中。在生产、使用及处置过程中会逐渐释放到环境中，引发潜在毒害风险[6-8]，尤其是对水生生物具有毒性，低浓度TBBPA就具有内分泌干扰和生殖等毒性作用效应[9-11]。

2016年3月，欧盟持久性有机污染物(POPs)法规(EC)No.850/2004进行修订，将HBCDs正式加入附录禁用物质列表，即HBCDs含量超过100 mg/kg的物质、混合物或物品禁止进入欧盟市场。湖北省食品安全地方标准(DBS 42/004-2014)中规定：动物性食品中六溴环十二烷异构体(α，β，γ-HBCD)和TBBPA的限量标准分别为0.102，0.032，0.058，0.103 ng/g。我国目前尚无关于土壤中HBCDs的限量标准。

因此，建立针对HBCDs和TBBPA的分析方法，监控其在环境介质中的变化情况显得尤为重要。由于HBCDs在160 ℃以上会发生异构体重排，在240 ℃以上有脱溴降解现象,因此气相色谱或气相色谱-质谱不适于分析HBCDs[12]。近年来，LC-MS/MS逐渐被用于HBCDs异构体的分离分析，如金军等[13]利用超高效液相色谱-电喷雾离子源-串联三重四极质谱分析了土壤中的六溴环十二烷，α-HBCD的检出限达20 pg/g。TBBPA虽可用气相色谱或气相色谱-质谱联用进行分析，但需繁琐的衍生化处理[14]，而LC-MS/MS分析方法由于稳定性好、速度快和灵敏度高的特点被应用于TBBPA的检测。

为实现HBCDs和TBBPA的同时分析，开发简单快速的LC-MS/MS分析方法成为研究热点之一。部分学者在此领域做了一定的工作，分析的对象包括土壤、水体和动物源食物[15-18]。其中，李芳等[15]建立了一种同时分析土壤中HBCDs和TBBPA的LC-MS/MS技术，方法灵敏度较高，TBBPA，α-HBCD，β-HBCD 和γ-HBCD 的检出限分别为0.031 5，0.767，0.197，0.163 ng/g。该技术以索氏提取法提取了土壤样品，耗时较长(16 h)，无法满足批量土壤样品的快速集成分析。为此，本文采用加速溶剂萃取技术对土壤样品进行批量处理，液相色谱-三重四极杆串联质谱(LC-MS/MS)同时分析六溴环十二烷3种异构体和四溴双酚A，方法无需衍生化处理，操作简单、快速，适合大量样品的快速集成分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

API4000高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(美国应用生物系统公司)；Dionex 200型加速溶剂萃取仪(美国戴安公司)；Metler Toledoal 204电子天平(瑞士梅特勒公司)；KL512/519J型氮吹仪(北京康林科技有限公司)。甲醇、乙腈、丙酮、正己烷(农残级，Fisher Scientific公司)；实验用水为Millipore高纯水；Sep-pak C18固相萃取柱(3 cc/500 mg，Waters公司)。标准品：HBCDs的3种非对映异构体标准溶液α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD以及TBBPA标准溶液(质量浓度为100 mg/L，溶于甲苯)购自美国Accustandard公司。

1.2 标准系列的配制

单标储备液：分别准确量取100 mg/L的α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD和 TBBPA标准溶液适量，分别以甲醇稀释，得到浓度为10 mg/L和1 mg/L的各物质的单标储备液。

混标储备液：分别取浓度为10 mg/L的α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD和TBBPA单标储备液100 μL，置于1 mL棕色瓶中，以甲醇稀释至刻度，即得1 mg/L的混标储备液。

标曲溶液：取适量的上述1 mg/L混标储备液，向其中添加适量的甲醇，得浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100，200 μg/L的混标溶液，置于冰箱中冷藏保存，待测。

1.3 样品制备

自然晾干的土壤样品，经土壤破碎机粉碎，过40目筛，四分法混匀。采用加速溶剂法萃取样品中的目标化合物。准确称取10 g混匀样品，以正己烷和丙酮混合液(体积比3∶1)为溶剂，120 ℃萃取温度,5 min预热，10 min静态时间，萃取压力10.0 MPa，循环2次，吹扫90 s。提取液用氮气浓缩后，以1 mL正己烷复溶，待净化。

依次以二氯甲烷(2 mL)和甲醇(2 mL)对Sep-pak C18固相萃取柱进行活化和平衡。土壤样品浓缩液上柱，样品瓶中残留浓缩液需用1 mL正己烷润洗1次，合并上样；弃去流出液后，用6 mL二氯甲烷进行洗脱，收集洗脱液于带尾锥管的K-D瓶中。将K-D瓶中的洗脱液氮吹浓缩近干，加入2 mL甲醇，振荡混匀后，过0.45 μm滤膜，待测。

1.4 色谱-质谱条件

液相色谱条件：美国Waters公司X Bridge C18柱(2.1 mm × 150 mm × 3.5 μm)；柱温30 ℃；进样量5 μL。以甲醇(A)和水(B)为流动相进行线性梯度洗脱，流速300 μL/min。梯度洗脱条件：0～1.0 min，30%～90% A；1.0～5.0 min，90%A；5.0～5.5 min，90%～95%A；5.5～12.0 min，95%A；12.0～15.0 min，95%～30%A；15.0～20.0 min，95%～30%A。

质谱条件：ESI电喷雾离子源，多反应监测(MRM)；负离子扫描；离子喷射电压为-4 500 V；雾化温度400 ℃;GS1：65 psi;GS2：40 psi；Curtain Gas：35 psi；CAD：10 psi；各化合物的解簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞能(CE)和碰撞室出口电压(CXP)参数见表1。

表1 α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD和TBBPA的母离子、子离子及部分质谱参数Table 1 Precursor ions,product ions and some MS/MS parameters for α-HBCD,β-HBCD,γ-HBCD and TBBPA

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

与索氏提取、超声提取和经典的分液漏斗等成熟方法相比，加速溶剂萃取技术具有有机溶剂用量少、快速、基体影响小、萃取效率高、选择性好和自动化程度高等优点，尤其适用于土壤、底泥等复杂基质固体样品的前处理。为实现HBCDs与TBBPA的同时快速批量集成化分析，本实验采用加速溶剂萃取技术提取土壤中的目标物。

在文献[14]的基础上，以正己烷-丙酮混合溶液(3∶1)为萃取溶剂，萃取压力为10.0 MPa，预热时间为5 min，吹扫90 s，循环2次，对HBCDs与TBBPA的萃取温度和萃取时间进行优化，测定3次，取平均值。发现当萃取温度为90，120，150 ℃时，4种待测物(α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD,TBBPA)的平均回收率分别为75.7%～91.4%，83.3%～102.4%和78.9%～89.4%。因此，目标化合物的最佳ASE萃取温度选择为120 ℃。另外，还考察了不同萃取时间下(6，8，10，12，14 min)的回收率，发现萃取6 min 和8 min时，回收率较低，当萃取时间为10 min时，回收率达83.5%～99.4%。延长萃取时间至12 min 和14 min，对回收率并无明显改善。考虑到实验成本，选择静态萃取时间为10 min。

净化程序上，分别考察了Oasis HLB，Supelclean LC-SCX 和Sep-pak C183种固相萃取柱的净化效果，发现采用Sep-pak C18固相萃取柱净化时，基线平稳且杂质少，效果较好。因此本实验采用Sep-pak C18固相萃取柱净化。

2.2 液相色谱-质谱条件的优化

2.2.1 液相色谱条件的优化 以实验室现有的Luna C18柱(150 mm × 2.0 mm，3 μm)，X Bridge C18(2.1 mm × 150 mm，3.5 μm)和Symmetry C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)对α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD 和TBBPA进行分离，发现4种目标物在Luna C18柱上的相对保留时间较短，分离效果一般，峰形较差；以Symmetry C18进行分析时，目标化合物的保留时间过长，不适合批量样品的快速集成测试；在X Bridge C18柱上，目标化合物均可实现基线分离，具有较好的分离效果，且分析速度快，符合批量快速测试的要求，因此最终选择X Bridge C18柱对目标物进行分析。

实验还考察了以甲醇-水、乙腈-水作流动相时的分离情况，发现以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱的分离效果优于乙腈-水为流动相进行梯度洗脱时的分离效果，且基线更稳定。据文献报道，流动相中添加1 mmol/L 醋酸铵能提高TBBPA的质谱响应[19]，因此实验也考察了甲醇-醋酸铵水溶液(1 mmol/L)作流动相时的效果，发现醋酸铵的加入会造成六溴环十二烷的质谱响应大大降低。因此本实验选择甲醇-水作为流动相。

2.2.2 质谱条件的优化 通过针泵进样技术确定各目标化合物定性和定量使用的母离子和子离子，形成离子对以MRM模式优化与化合物本身性质有关的质谱参数(DP、EP、CE和CXP)。质谱连接液相色谱后通过流动注射(FIA)模式优化与流动相有关的质谱参数(离子源GS1、GS2、Curtain Gas、碰撞气、温度、喷雾电压)，优化结果见表1。

2.3 线性关系与检出限

在最佳LC-MS/MS条件下，测定不同浓度的混标溶液，不加权最小二乘法进行回归运算，获得标准工作曲线。4种化合物的线性范围为0.50～200.0 μg/L，相关系数(r)均大于0.998。采用逐步稀释法测定各物质的检出限。α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD 和TBBPA的检出限(S/N≥3)分别为2.80，1.80，2.40，10.0 ng/kg，定量下限(S/N≥10)分别为9.40，6.00，8.00，33.4 ng/kg(见表2)。图1为4种化合物标准溶液(10 μg/L)的HPLC-MRM谱图。

表2 目标化合物的保留时间、回归方程、线性范围及检出限Table 2 Retention times,linear equations,linear ranges and LODs of α-HBCD,β-HBCD,γ-HBCD and TBBPA

*Yrepresents concentration of compound(μg/L),Xrepresents peak area

2.4 回收率与精密度

选择经400 ℃下灼烧后的土壤样品进行LC-MS/MS分析，确认无目标化合物后将其作为空白样品使用。取上述空白土壤样品10 g，分别向其中添加高、中、低3个水平的混标溶液，得到浓度分别为1.0，10.0，40.0 μg/kg的加标样品。按照实验方法对样品进行处理和测定，每个浓度水平重复测定6次，结果见表3。

结果显示：在1.0～40.0 μg/kg 添加水平内，α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD 和TBBPA的平均加标回收率为73.8%～106.9%，相对标准偏差(RSD)为5.8%～11.2%。方法具有较好的回收率与精密度，满足检测要求。

表3 加标回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of the method(n=6)

2.5 实际样品分析

为考察所建立方法在环境样品分析中的实用性，采用该方法分析了江苏省常熟市区域内的3个表层土壤样品。图2给出了实际样品的HPLC-MRM谱图。结果表明：α-HBCD,β-HBCD,γ-HBCD 和TBBPA均有检出，其含量分别为9.5～83.6 μg/kg，12.3～78.7 μg/kg，6.8～95.7 μg/kg和16.8～69.6 μg/kg。

3 结 论

本文建立了一种能同时快速检测HBCDs 3种异构体和TBBPA的高效液相色谱-三重四极杆串联质谱分析方法。目前，我国尚未发布土壤中HBCDs和TBBPA的含量限量国家标准。湖北省食品安全地方标准《动物性食品中六溴环十二烷和四溴双酚A的测定(DBS42/004-2014)》中规定α，β,γ-HBCD和TBBPA的限量标准分别为0.102，0.032，0.058，0.103 ng/g(以脂肪计)。本方法的检出限为1.80～10.0 ng/kg，低于该地方限量标准，且略优于文献[15]的检出限(31.5～767 ng/kg)，因此完全满足实际样品测定的需求。方法能有效地消除土壤样本中复杂基质的干扰，保证分析检测的准确性，且灵敏度高，简便快速，可以满足实际样品批量测试的需要。

[1] Shi Z X,Tong T,Jiao Y,Wang J D,Huang M R,Li X.J.FoodSaf.Qual.(施致雄,仝彤,焦扬,王建迪,黄默容,李潇.食品安全质量检测学报),2015,6(4):1333-1341.

[2] Qian Y,Zhu X Y.Ecol.Environ.Sci.(钱翌,朱晓艳.生态环境学报),2014,23(8):1390-1395.

[3] Ma Q,Bai H,Wang C,Xi H W,Ma W,Zhou X,Dong Y Y,Wang B L.Chem.J.Chin.Univ.(马强,白桦,王超,席海为,马微,周新,董益阳,王宝麟.高等学校化学学报),2010,31(3):473-478.

[4] Marvin C H,Tomy G T,Alaee M,Macinnis G.Chemosphere,2006,64(2):268-275.

[5] Ali N,Harrad S,Goosey E,Neels H,Covaci A.Chemosphere,2011,83(10):1360-1365.

[6] Yan M Y,Pang Z H,Li X M,Chen J Y,Li J S.Environ.Sci.Technol.(闫梦玥,庞志华,李小明,谌建宇,黎京士.环境科学与技术),2013,36(4):49-54.

[7] Li Y N,Zhou Q X.Chin.J.Ecol.(李亚宁,周启星.生态学杂志),2008,27(2):263-268.

[8] Abdallah M A E,Harrad S,Covaci A.Environ.Sci.Technol.,2008,42(18):6855-6861.

[9] Kuiper R V,Van den Brandhof E J,Leonards P E G,Van-Der-Ven L T M,Wester P W,Vos J G.Arch.Toxicol.,2007,81(1):1-9.

[10] Debenest T,Gagne F,Petit A N,Andre C,Kohli M,Blaise C.Comp.Biochem.Physiol.:C,2010,152(4):407-412.

[11] Liu H L,Liu X H,Wang X Y,Wang X R,Yu H X.Environ.Sci.(刘红玲,刘晓华,王晓祎,王晓蓉,于红霞.环境科学),2007,28(8):1784-1787.

[12] Covaci A,Voorspoels S,de Boer J.Environ.Int.,2003,29(6):735-756.

[13] Jin J,Yang C Q,Wang Y,Liu A M.Chin.J.Anal.Chem.(金军,杨从巧,王英,刘安明.分析化学),2009,37(4):585-588.

[14] Zheng L,Weng D H,Liang F,Hua Z J.Phys.Test.Chem.Anal.:Chem.Anal.(郑琳,翁东海,梁帆,华正江.理化检验-化学分册),2012,48(12):1438-1440.

[15] Li F,Jin X,Wang L X,Ni Y W,Su F,Chen J P.Environ.Chem.(李芳,金静,王龙星,倪余文,苏凡,陈吉平.环境化学),2013,32(7):1370-1375.

[16] Zhang Y,Zhang B B,Mu S,Hu G J,Wang H.Environ.Sci.Technol.(章勇,张蓓蓓,穆肃,胡冠九,王荟.环境科学与技术),2014,37(4):107-112.

[17] Fan Y Q,He H,Wen S,Gong Y,Li Y G,Hu D J.J.Anal.Sci.(范允卿,何慧,闻胜,龚艳,李永刚,胡定金.分析科学学报),2014,30(2):158-162.

[18] Lankova D,Kockovska M,Lacina O,Kalachova K,Pulkrabova J,Hajslova J.Anal.Bioanal.Chem.,2013,405(24):7829-7839.

[19] Chu S G,Haffner G D,Letcher R J.J.Chromatogr.A,2005,1097(1/2):25-32.

Determination of Hexabromocyclododecanes and Tetrabromobisphenol A in Farmland Soils by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Xiao-chun1,2*,TAO Jing1,LI Tie-chun1

(1.Department of Chemistry and Life Science,Anshan Normal College,Anshan 114016,China;2.National Research Center for Geoanalysis,Beijing 100037,China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method(HPLC-MS/MS) was developed for the simultaneous determination of hexabromocyclododecanes(HBCDs) and tetrabromobisphenol A(TBBPA) in farmland soils.Samples were extracted by accelerated solvent extraction(ASE) and purified with Sep-pak C18solid phase extraction(SPE) cartridges.The targeted compounds were separated on an X Bridge C18(150 mm × 2.1 mm × 3.5 μm) using methanol-water as mobile phases,and then analyzed by HPLC-MS/MS in multiple reaction monitoring(MRM) mode with negtive electrospray ionization.The target compounds had good linear relationships(r≥ 0.998) in the range of 0.50-200.0 μg/L.The limits of detection(S/N≥ 3) were in the range of 1.80-10.0 ng/kg,and the average recoveries at spiked levels of 1.0- 40.0 μg/kg ranged from 73.8% to 106.9%with RSDs of 5.8%-11.2%.The method was successfully applied in the detection of HBCDs and TBBPA residues in practical farmland soils.

accelerated solvent extraction(ASE)；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);farmland soil;hexabromocyclododecanes(HBCDs);tetrabromobisphenol A(TBBPA)

2016-05-09；

2016-07-19

国家自然科学基金资助项目(41430641，41140032)；中国地质局地质调查工作项目(1212351211006)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.11.012

O657.63;TQ314.248

A

1004-4957(2016)11-1440-05

*通讯作者：王晓春，博士，副研究员,研究方向：环境分析化学，Tel:0412-2960058，E-mail:wangwxc@iccas.ac.cn