六味地黄丸治疗SD大鼠酒精性绝经综合征的作用研究

2016-04-13 06:12魏立雯赵海赵明德魏微刘青青韩建红付陆
四川动物 2016年4期
关键词:六味地黄酒精性卵巢

魏立雯, 赵海, 赵明德, 魏微, 刘青青, 韩建红, 付陆*

(1. 西南医科大学实验动物中心,四川泸州646000; 2. 贵阳中医学院实验动物研究所,贵阳550025)

六味地黄丸治疗SD大鼠酒精性绝经综合征的作用研究

魏立雯1, 赵海2, 赵明德1, 魏微1, 刘青青1, 韩建红1, 付陆1*

(1. 西南医科大学实验动物中心,四川泸州646000; 2. 贵阳中医学院实验动物研究所,贵阳550025)

为了研究六味地黄丸在治疗酒精性绝经综合征SD大鼠中的作用,构建酒精性绝经综合征大鼠模型,然后观察六味地黄丸对大鼠精神状态、饮食、体质量等的影响。HE染色显微镜下观察卵巢形态学的变化,测定血清雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)的含量,检测白介素-6(IL-6)在卵巢和子宫中的mRNA表达水平。结果发现:六味地黄丸促进了卵巢各级卵泡发育及生长,减轻了卵巢炎症、囊肿、萎缩状态;提高了试验组E2水平,降低了试验组FSH、LH的水平(P<0.01),而IL-6基因在卵巢和子宫中的mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.01)。本研究证实六味地黄丸可以明显改善酒精性绝经综合征SD大鼠的激素分泌水平,可以考虑运用于人类临床上绝经综合征的治疗,并且细胞因子IL-6可以为绝经综合征和自身免疫性卵巢早衰的诊断与治疗,提供另一个可靠的临床参照。

六味地黄丸;绝经综合征;白介素-6;动物模型

绝经综合征(menopausal syndrome)是指妇女绝经(一般在45~55岁)前后,由于卵巢功能衰退,出现性激素波动或减少所致的一系列躯体及精神心理症状,会给患者带来极大的痛苦(Campbell & Whitehead,1977)。目前,西医习惯用激素替代疗法(hormone replacement therapy,HRT)来治疗和缓解本病症状,虽有一定的疗效,但副反应较多,长期应用会有致癌风险(Nelsonetal.,2002)。而我国传统中医辨证应用中草药可以从益气养血、滋肾养肝、补肾滋阴、解郁安神、健脾清心等方面对绝经综合征进行治疗(李淑芳,2014;桑海莉,桑雨廷,2014),在改善卵巢、子宫功能方面具有疗效显著、副作用小等优点。近年来随着临床应用和药理研究的深入,人们发现六味地黄丸有不少新用途。六味地黄丸是滋补肾阴的代表方剂,在治疗结核、围更年期失眠、肾病、肾阴虚型经间期出血等疾病具有明显疗效(李保院等,2014;李红,2014)。然而,将六味地黄丸运用于治疗绝经综合征的报道很少,其对机体调节作用的具体分子机制更有待深入探讨(吴炜景等,2011;李沫函等,2013;王萍,王喜军,2013;翁小微,周惠芳,2015)。此外,研究人员发现自身免疫性卵巢早衰的发生发展均与白介素-6(IL-6)浓度变化相关(庄粤冰,2015),表明其在绝经综合征的诊治过程中具有临床意义。本研究拟用酒精性绝经综合征SD大鼠,探讨六味地黄丸对大鼠卵巢组织形态学差异,性激素分泌水平以及IL-6基因mRNA表达水平的影响,为六味地黄丸在绝经综合征防治中的新功用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 健康SPF级雌性SD大鼠80只,6~8周龄,体质量200 g±10 g,由西南医科大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(川)2013-17,实验动物使用许可证号:SYXK(川)2013-065。六味地黄丸(太极集团重庆中药二厂有限公司,批号1507126),戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司,批号167A),注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂,批号CC1409027-1),无水乙醇(AR)(市售),雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)ELISA检测试剂盒均购自Sigma公司。荧光定量试剂盒iQTMSYBR Green Supermix购自美国伯乐(Bio-Rad)生命医学产品(上海)有限公司。

1.1.2 主要仪器 酶标仪(Multiskan FC,美国Thermo公司),CFX96TM实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司),FA2104A电子天平(上海精天电子仪器公司),YJ-1450超净工作台(苏州华新空调净化有限公司),低温离心机(德国Eppendorf公司),低温冰箱(日本SANYO公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组及模型构建 80只健康SPF级雌性SD大鼠,正常饲养1周,称重,尾静脉取血检测雌激素水平,选取处于动情期的60只SD大鼠,将其随机分为5组(每组12只):正常对照组(HC)、模型对照组(MⅠ)、阳性药戊酸雌二醇对照组(MⅡ)、六味地黄丸低剂量组(MⅢ)和六味地黄丸高剂量组(MⅣ)。HC正常饲养,不做任何处理。绝经综合征模型的构建主要根据卢金福等(2006)的方法,具体操作步骤如下:将SD大鼠称重,以1%的戊巴比妥钠每200 g体质量1 mL腹腔注射麻醉;大鼠取侧卧位,在最末肋骨下,脊柱外侧1.5~2 cm处剪除被毛,常规用75%乙醇消毒皮肤,切开皮肤和背肌约2 cm;用小的钝头镊子将切口视野中白色发亮的脂肪团拉出,找到卵巢,将0.2 mL无水乙醇注射到卵巢内,随即将卵巢送回大鼠腹腔内;以同样方法处理对侧卵巢;先缝合肌肉层,再缝合皮肤,皮肤消毒,连续5 d腹腔注射青霉素钠1 mL(20万单位)。

1.2.2 药物处理及采样 5组SD大鼠饲喂于西南医科大学实验动物中心SPF屏障系统中,温度20 ℃~24 ℃,相对湿度40%~70%,系统控制光照时间为08∶00—20∶00,自由饮食。手术造模5 d后,分别对各组SD大鼠进行不同药物的灌胃处理。HC正常饲养、不做灌胃处理。MⅠ给予生理盐水,MⅡ、MⅢ和MⅣ分别给予0.09 mg·kg-1戊酸雌二醇、1 g·kg-1和10 g·kg-1的六味地黄丸灌胃处理。以上均为固定时间处理,每日1次,观察各组的精神状态及饮食状况,并每周称取体质量,根据体质量调整药量,持续4周。采样前称重每只大鼠,尾静脉采血并处死,离心取血清,采集双侧卵巢和子宫,生理盐水冲洗,分别称重卵巢、子宫,按照卵巢指数=卵巢质量/体质量,子宫指数=子宫质量/体质量来计算。一侧卵巢、子宫固定在4%多聚甲醛中,另一侧卵巢、子宫迅速放入-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 ELISA法检测血清中激素水平 在酶标仪上,按照ELISA试剂盒的说明检测血清中E2、FSH、LH的含量。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测IL-6基因的mRNA表达水平 本试验通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测IL-6基因在大鼠子宫和卵巢组织中mRNA的表达量。采用2-△△CT法(Vandesompeleetal.,2002),以GAPDH作为内参基因,在实时荧光定量PCR仪上完成。根据NCBI提供的IL-6基因和GAPDH基因的参考序列,设计荧光定量引物,由北京六合华大基因有限公司合成,其引物序列信息如下,GAPDH:F:5’-AGGGCATCTTGGGCTACAC-3’,R:5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3’(产物211 bp,退火温度58 ℃),IL-6:F:5’-GCACTGGCGGAAGTCAATCT-3’,R:5’-TTCTCAGCAGGCAGGTCTCAT-3’(产物94 bp,退火温度60 ℃)。按照试剂盒的使用说明书加样,使用标准品作为板间对照,并设空白对照,每个待测样3个重复。

1.2.5 数据处理 本试验所有数据以Mean±SE表示,运用SPSS 17.0分析处理,组间的差异比较采用单因素方差分析。P<0.01表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 卵巢组织形态学差异

大鼠解剖后,通过对卵巢的形态学观察发现,与HC比较,MⅠ的卵巢组织发生了明显萎缩(9/12)或者病变为双侧囊性囊肿(3/12),而MⅡ、MⅢ、MⅣ中的卵巢组织只发生了轻微的萎缩,病变为囊肿的个体仅有1个(1/36)。如图1所示,通过HE切片观察,

HC各级卵泡正常生长,形态规则,排列紧密。卵母细胞形态完整,呈球形,细胞核圆润规则,透明带清晰可见。与HC比,MⅠ中闭锁卵泡明显增多,生长卵泡和成熟卵泡明显减少,而MⅡ、MⅢ、MⅣ中各级卵泡生长状况有很大程度改善,成熟卵泡增加,MⅡ和MⅣ中的卵巢组织形态接近HC,其中MⅣ中的效果更好,说明戊酸雌二醇和六味地黄丸对酒精性绝经综合征的治疗有一定的作用。

图1 各组SD大鼠卵巢组织HE染色结果(×100)Fig. 1 HE staining of the ovarian from different groups of SD rats (×100)

2.2 子宫和卵巢指数

如图2所示,各组SD大鼠的子宫指数差异无统计学意义(P>0.01)。与HC比较,MⅠ的卵巢指数明显下降(P<0.01)。经戊酸雌二醇和不同浓度六味地黄丸灌胃治疗后,与MⅠ比较,MⅡ和MⅣ中的卵巢指数明显提高(P<0.01),而MⅢ的差异无统计学意义(P>0.01)。

2.3 E2,LH和FSH血清水平的变化

如图3所示,与HC比较,M Ⅰ的E2水平明显下降(P<0.01),表现为卵巢对E2的分泌功能下降,说明造模成功。经过戊酸雌二醇和不同浓度六味地黄丸灌胃治疗后,与M Ⅰ比较,M Ⅱ、M Ⅲ和M Ⅳ中的E2水平明显提高(P<0.01),接近HC的水平(P>0.01)。与HC比较,MⅠ的LH和FSH水平明显升高(P<0.01)。经过药物灌胃治疗后,与MⅠ比较,MⅡ、MⅢ和MⅣ中的LH和FSH水平均显著降低(P<0.01),接近HC的水平(P>0.01)。

2.4IL-6基因在卵巢和子宫中mRNA的差异表达

如图4所示,子宫中IL-6基因的mRNA表达差异在HC和MⅠ间有统计学意义(P<0.01),而其余各组间差异无统计学意义。与HC相比,MⅠ卵巢中IL-6基因的mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.01);与MⅠ相比,MⅡ、MⅢ和MⅣ中IL-6基因的mRNA表达差异均有统计学意义(P<0.01);而MⅡ、MⅢ和MⅣ间IL-6基因的mRNA表达差异无统计学意义(P>0.01)。

图2 各组SD大鼠的子宫和卵巢指数Fig. 2 The index of uterine and ovarian of SD rats in different groups

UI. 子宫指数, OI. 卵巢指数; 与HC比较,#P<0.01, 与MⅠ比较,*P<0.01; 下同。

UI. uterus index, OI. ovary index; compared with HC,#P<0.01, compared with MⅠ,*P<0.01; the same below.

图3 各组SD大鼠血清中E2,LH和FSH的含量Fig. 3 The levels of E2, LH and FSH in serum of SD rats in different groups

图4 IL-6基因在各组SD大鼠子宫和卵巢组织中mRNA的表达Fig. 4 The mRNA expression levels of IL-6 gene in uterus and ovary of SD rats in different groups

3 讨论

绝经综合征可导致性激素波动或减少,给患者的身心健康带来极大痛苦。自身免疫性卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是原发或继发性闭经,且血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低,伴有一系列不同程度的低雌激素症。绝经综合征和POF在临床表现水平上极为相似(Scheidt-Naveetal.,2001)。目前,应用较多的HRT因为有阴道出血、乳房胀痛等副反应,还可能增加患者子宫内膜癌、乳腺癌的风险(Collaborators,2003;汤海霞,2014),探寻HRT以外的更为安全有效的治疗方法是大势所趋。因此,临床上广大绝经综合征患者倾向于使用中草药治疗,而大多实践表明补肾中药和中医情志治疗妇女绝经综合征具有较好的疗效,可以缓解或减轻各种症状,使其内分泌功能达到新的平衡(王小云等,2006)。同时,有研究表明中医药及植物雌激素可用于改善主观症状,二仙汤及大豆黄酮对酒精性绝经综合征SD大鼠的卵巢和内分泌具有一定影响(林静,刘英杰,2014;夏斌等,2015)。

目前,用于绝经综合征的动物模型较少,主要有自然衰老模型、卵巢摘除模型、X射线照射破坏卵巢模型、卵巢摘除配合中药造模等。这些造模方法各自都存在利弊,均不能够准确、全面地反映绝经综合征的临床症状。卢金福等(2006)研究发现酒精性绝经综合征模型大鼠可以作为一个较为理想的模型,因为动物残存有少量的正常卵巢组织,与卵巢摘除等造模方法相比,更接近临床。本研究用健康雌性SD大鼠,复刻了酒精性绝经综合征模型,通过临床和组织切片观察可以确定造模成功,后采用六味地黄丸对绝经综合征模型大鼠进行干预,以临床常用HRT治疗作为对照。结果显示,MⅣ血清中E2水平明显高于MⅠ(P<0.01),血清中LH、FSH水平明显低于MⅠ(P<0.01),提示六味地黄丸具有类似雌激素的作用,可以用于临床上绝经综合征和POF的治疗。

目前认为,细胞因子可参与卵巢多方面功能的调节,卵巢抗原可以激发机体免疫系统,产生抗卵巢抗体,促进免疫细胞及细胞因子的改变(Hoeketal.,1997)。研究人员发现POF患者血液中白细胞介素水平与临床症状存在显著相关性(Scheidt-Naveetal.,2001;Ottetal.,2014),但没有检测其组织表达差异。本研究通过qPCR在子宫和卵巢组织中检测IL-6基因在不同实验组的mRNA差异表达水平,结果发现与HC相比,IL-6基因在子宫、卵巢的表达量与MⅠ差异有统计学意义(P<0.01);MⅡ、MⅢ和MⅣ间IL-6基因的mRNA表达差异无统计学意义(P>0.01)。以上结果表明,在卵巢和子宫组织中IL-6表达水平与其在血液中的水平有相同趋势,进一步揭示IL-6在POF的诊治过程中有重要的临床意义。

4 结论

六味地黄丸可以明显改善酒精性绝经综合征SD大鼠的激素分泌水平,可以考虑运用于人类临床上绝经综合征的治疗,且细胞因子IL-6可为绝经综合征和自身免疫性卵巢早衰的诊断与治疗提供另一个可靠的临床参照。

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Investigation of Liuwei Dihuang Wan on the Treatment of Alcoholic Menopausal Syndrome in SD Rats

WEI Liwen1, ZHAO Hai2, ZHAO Mingde1, WEI Wei1, LIU Qingqing1, HAN Jianhong1, FU Lu1*

(1. Department of Laboratory Animal, Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan Province 646000, China;2. Institute of Medical Laboratory Animals, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China)

To study the effect of Liuwei Dihuang Wan on the diagnosis and treatment of alcoholic menopausal syndrome (MS) in SD rats. The MS rat model was first induced by ethanol, and then the effect of Liuwei Dihuang Wan on the mental state, diet, and body weight of rats was detected. The ovarian histomorphology was tested with HE staining and checked using microscope. The levels of estradiol (E2), follicle stimulating hormone (FSH), and luteinizing hormone (LH) in serum were detected. The mRNA expression levels of interleukin-6 (IL-6) in the ovary and uterus were also monitored by qPCR. The results showed that Liuwei Dihuang Wan could improve the growth and development of ovarian follicles, and increase the level of E2 but significantly decrease the level of FSH and LH in serum (P<0.01). Furthermore, the mRNA expression levels ofIL-6 gene in the ovary and uterus were significantly different (P<0.01). In conclusion, Liuwei Dihuang Wan can be used for the therapy of alcoholic MS. Meanwhile, IL-6 may be a potential target for the diagnosis and treatment of autoimmune premature ovarian and MS.

Liuwei Dihuang Wan; menopausal syndrome; IL-6; animal model

2016-05-17 接受日期:2016-06-08 基金项目:四川省泸州市泸州医学院院级基金项目(泸医院科[2015]1号)

魏立雯(1987—), 女, 硕士, 主要从事实验动物学研究, E-mail:weilwen55@swmu.edu.cn

*通信作者Corresponding author, 男, 博士, 主要从事分子生物学研究, E-mail:flfyh@swmu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160129

Q95-33

A

1000-7083(2016)04-0579-05

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