STAT-1对白介素1β诱导的关节软骨细胞衰老的影响及其可能机制研究

冯 欣，李 垚

121000辽宁省锦州市，辽宁医学院附属第一医院风湿免疫科(冯欣)；辽宁医学院生理学教研室(李垚)



·论著·

STAT-1对白介素1β诱导的关节软骨细胞衰老的影响及其可能机制研究

冯 欣，李 垚

121000辽宁省锦州市，辽宁医学院附属第一医院风湿免疫科(冯欣)；辽宁医学院生理学教研室(李垚)

【摘要】目的探讨STAT-1对白介素1β(IL-1β)诱导的关节软骨细胞衰老的影响及可能机制。方法软骨细胞同步化后分为：正常对照组(正常培养的软骨细胞)；IL-1β组(加入IL-1β，浓度为10 ng/ml)；阴性对照组(加入IL-1β和空白质粒)；STAT-1转染组(加入IL-1β和siRNA-STAT-1重组质粒)。检测各组细胞的β-半乳糖苷酶染色阳性率；采用MTT法检测4组细胞培养24、48、72 h时的增殖情况；Western blotting法检测4组细胞STAT-1蛋白的表达水平；采用端粒酶检测试剂盒进行端粒酶活性测定。结果细胞培养24 h时，各组细胞的增殖率比较，差异无统计学意义(F=3.037，P=0.087)。细胞培养48 h和72 h时，各组细胞的增殖率比较，差异均有统计学意义(F=3.754，P<0.05；F=3.871，P<0.05)；其中IL-1β组、阴性对照组细胞增殖率均分别低于正常对照组、STAT-1转染组，差异均有统计学意义(P<0.05)。正常对照组β-半乳糖苷酶染色阳性率为(12.11±1.34)%，IL-1β组为(65.62±2.56)%，阴性对照组为(60.73±3.21)%，STAT-1转染组为(21.32±2.21)%，4组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率比较，差异有统计学意义(F= 2.877，P<0.05)；其中IL-1β组和阴性对照组均高于正常对照组和STAT-1转染组，差异均有统计学意义(P<0.05)。4组STAT-1表达水平比较，差异有统计学意义(F=236.150，P<0.05)；其中IL-1β组和阴性对照组STAT-1表达水平均高于正常对照组和STAT-1转染组，差异均有统计学意义(P<0.05)。正常对照组端粒酶活性为(81.65±5.28)%，IL-1β组为(60.32±5.32)%，STAT-1转染组为(76.76±3.45)%。3组端粒酶活性比较，差异有统计学意义(F=26.040，P<0.05)；其中IL-1β组端粒酶活性低于正常对照组和STAT-1转染组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论STAT-1在IL-1β诱导的衰老关节软骨细胞中表达水平升高，可能通过影响端粒酶活性而参与软骨细胞的衰老。

【关键词】骨关节炎；STAT-1；白介素1β;端粒酶;细胞衰老

冯欣，李垚.STAT-1对白介素1β诱导的关节软骨细胞衰老的影响及其可能机制研究[J].中国全科医学，2016，19(11)：1310-1313.[www.chinagp.net]

Feng X，Li Y.Influence of STAT-1 on articular cartilage cells senescence induced by IL-1β and the possible mechanism[J].Chinese General Practice，2016，19(11)：1310-1313.

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是由多种原因引起的关节软骨的非炎症性退行性变，表现为关节疼痛、活动受限，最终可导致关节畸形和功能障碍[1]。OA患病率随着年龄增长而增加，随着人口老龄化，OA已经成为极常见的疾病，是备受关注的医疗和社会问题。

OA最基本的病理改变为关节软骨的退行性变和消失，而软骨细胞的衰老是其重要的分子机制。JAK/STAT通路是参与细胞衰老发病过程的一条重要的信号转导通路，JAK/STAT通路参与了多种细胞的衰老，而在软骨细胞衰老中的作用尚不清楚。为此，本实验首先研究STAT-1在白介素1β(IL-1β)诱导的衰老的关节软骨细胞中的表达水平，明确STAT-1在衰老的关节软骨细胞中的表达变化，进一步应用STAT-1的沉默载体，转染入关节软骨细胞，检测细胞衰老指标的变化，探讨STAT-1对关节软骨细胞衰老的影响及可能机制。

1材料与方法

1.1材料与试剂大鼠关节软骨细胞(购自上海博慧斯公司)；低糖DMEM培养基(Gibco公司，美国)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；MTT(Sigma公司，美国)；兔抗大鼠STAT-1多克隆抗体(santa cruz公司)；HRP-标记的羊抗兔二抗(中杉公司)；β-半乳糖苷酶染色试剂盒(上海杰美基因有限公司)；端粒酶活性检测试剂盒(德国Roche Diagnostics公司)。

1.2实验方法

1.2.1软骨细胞培养及分组软骨细胞在37 ℃ 5% CO2，DMEM(含糖5.5 mmol/L)培养液中培养至亚融合(70%～80%)状态后，换无血清DMEM培养液，继续培养24 h，使细胞同步化后分为：正常对照组(正常培养的软骨细胞)；IL-1β组(加入IL-1β，浓度为10 ng/ml)；阴性对照组(加入IL-1β和空白质粒)；STAT-1转染组(加入IL-1β和siRNA-STAT-1重组质粒)。

1.2.2STAT-1沉默载体表达的构建设计并合成能够特异性抑制STAT-1基因的RNAi序列，将其克隆入RNAi载体pGenesil，获得pGenesil-siRNA-STAT-1重组载体，脂质体法转染关节软骨细胞。

1.2.3β-半乳糖苷酶染色各组细胞培养至48 h后，PBS洗涤3次，室温固定细胞5 min(固定液配方：2%甲醛，0.2%戊二醛)，PBS洗涤3次后，加上新配制的1 ml衰老相关的β-半乳糖苷酶染液，置于37 ℃(无CO2)温育12～16 h，观察细胞胞质中蓝色沉淀，并于每个样本随机选择6个视野，计数阳性细胞百分数。

1.2.4MTT法检测细胞增殖率各组细胞接种于96孔板，同步化后，在培养24、48、72 h后分别测细胞增生率。采用MTT法：培养结束后加入MTT(5 g/L)20 μl，于37 ℃培养箱孵育4 h后，吸去MTT液，每孔分别加入二甲基亚砜(DMSO)200 μl，用水平摇床摇匀震荡10 min，用酶标仪观察，在490 nm波长处记录各组吸光度值。细胞增生率=(IL-1β组吸光度值-实验组吸光度值/IL-1β组吸光度值)×100%。

1.2.5软骨细胞中STAT-1的表达Western blotting法：各组细胞培养至48 h后，用RIPA裂解液裂解细胞，4 ℃离心(以12 000×g，离心5 min)，取上清液，BCA法测定蛋白浓度后，制成蛋白浓度相等的样品。8%聚丙烯酰胺凝胶上垂直电泳。电转印至硝酸纤维素膜上。5%的脱脂奶粉封闭2 h，加入STAT-1多克隆抗体(1∶1 000)，孵育过夜。洗膜后抗孵育过夜。二抗室温孵育2 h。碱性磷酸酶法显色。成像分析扫描仪扫描成像，Scinn Corporation分析软件进行灰度值半定量分析，待测蛋白与相应actin的条带灰度比值表示待测蛋白的相对含量。实验重复3次，取算术平均值进行统计分析。

1.2.6端粒酶活性测定各组细胞培养至48 h后，采用端粒酶检测试剂盒进行端粒酶活性测定。向装有反应液的PCR管中加入1 μl待测细胞裂解悬液，混匀，向PCR管中加入引物1 μl Tag酶混匀，滴加一滴石蜡油混匀，离心数秒，于30 ℃放置30 min，然后进行PCR扩增：进行35个循环，94 ℃ 40 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s。最后72 ℃保温5 min。PCR产物经12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过检测端粒酶合成的6 bp端粒DNA片段产物表示端粒酶活性表达。

2结果

2.1细胞增殖率细胞培养24h时，各组细胞的增殖率比较，差异无统计学意义(F=3.037，P=0.087)。细胞培养48h和72h时，各组细胞的增殖率比较，差异均有统计学意义(F=3.754，P<0.05；F=3.871，P<0.05)；其中IL-1β组、阴性对照组细胞增殖率均分别低于正常对照组、STAT-1转染组，差异均有统计学意义(P<0.05，见图1)。

注：IL-1β=白介素1β

图1不同时刻各组细胞增殖率

Figure1Cellproliferationofdifferentgroupsatdifferenttimepoints

2.2β-半乳糖苷酶染色阳性率比较正常对照组β-半乳糖苷酶染色阳性率为(12.11±1.34)%，IL-1β组为(65.62±2.56)%，阴性对照组为(60.73±3.21)%，STAT-1转染组为(21.32±2.21)%。4组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率比较，差异有统计学意义(F= 2.877，P<0.05)；其中IL-1β组和阴性对照组均高于正常对照组和STAT-1转染组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3STAT-1表达水平比较4组STAT-1表达水平比较，差异有统计学意义(F=236.150，P<0.05)；其中IL-1β组和阴性对照组STAT-1蛋白表达水平均高于正常对照组和STAT-1转染组，差异均有统计学意义(P<0.05，见图2、3)。

注：1=正常对照组，2=IL-1β组，3=阴性对照组，4=STAT-1转染组

图2各组STAT-1表达电泳图

Figure2ProteinelectrophoresiofSTAT-1ofeachgroup

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与STAT-1转染组比较，bP<0.05

图3各组细胞STAT-1表达水平比较

Figure3CompasisonofSTAT-1proteinexpressionlevelamongeachgroup

2.4端粒酶活性比较正常对照组端粒酶活性为(81.65±5.28)%，IL-1β组为(60.32±5.32)%，STAT-1转染组为(76.76±3.45)%。3组端粒酶活性比较，差异有统计学意义(F=26.040，P<0.05)；其中IL-1β组端粒酶活性低于正常对照组和STAT-1转染组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

OA是临床常见的关节病，是由于老年或其他原因如创伤、先天性异常等引起关节软骨的非炎症性退行性变及关节边缘骨赘形成。本病可累及多个关节，临床上可出现关节疼痛、活动受限，最终导致关节畸形和功能障碍。OA可从20岁开始就可以发病，患病率随着年龄增长而增加。50岁以上人群中，OA的发病率为50%，55岁以上的人群中，发病率为80%。我国OA的发病情况约占总人口的10%，约为1亿人。随着人口老龄化，OA已经成为常见疾病。由于关节畸形和功能障碍，严重影响患者的身体健康和生活质量，给家庭和社会带来了巨大的经济负担。OA已经成为备受关注的医疗和社会问题[2]。

OA的病因及发病机制至今尚未完全明确，目前认为其最基本的病理改变为软骨的退行性变和消失，导致软骨基质降解、软骨细胞死亡和关节完整性破坏。软骨细胞是成熟软骨组织内唯一的细胞类型，近年研究显示，软骨细胞过度凋亡和衰老可能对OA的发病产生了重要影响[3-4]。

IL-1β被广泛认为是调控OA机制的关键因子，其调节蛋白水解酶、细胞因子、一氧化氮(NO)、前列腺素和其他递质及组织炎性效应物的合成，驱动软骨损伤。已有研究证实，IL-1β能诱导关节软骨细胞发生退变[5]。本研究结果显示，应用IL-1β刺激软骨细胞48h后，与正常对照组相比，IL-1β组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率明显升高，MTT结果显示，IL-1β使细胞的增殖明显下降，提示IL-1β成功地诱导了关节软骨细胞发生衰老。

近年来越来越多的研究及证据表明，信号通路在调控衰老的起始和持续中起重要作用，细胞衰老后，多种激酶和转录因子被激活，涉及多种细胞内信号转导通路，并在多层次和诸多环节存在交互作用。JAK/STAT通路是参与细胞衰老发病过程的一条重要的信号转导通路，STATs家族是一种能与DNA结合的蛋白家族，哺乳动物细胞STAT家族成员主要包括STAT-1、STAT-2、STAT-3(α/β/γ)、STAT-4、STAT-5(A/B)和STAT-6。STAT-1是第一个被发现的STAT，其参与细胞的生长，可促进细胞的凋亡。STAT-1在不同衰老细胞中的表达也不一致，例如：STAT-1和P-STAT1在被干扰素诱导衰老大鼠的巨噬细胞中减少[6]；在血管紧张素Ⅱ诱导衰老人肾小球系膜细胞中STAT-1的表达水平升高[7]，而STAT-1在衰老的关节软骨细胞中表达如何变化国内外尚未见报道。本实验检测了在衰老的关节软骨细胞中STAT-1表达水平，结果显示：与对照组比较，IL-1β组STAT-1表达水平明显升高，提示STAT-1可能参与关节软骨细胞衰老的发生。在此基础上，进一步应用STAT-1的沉默载体转染入软骨细胞，结果显示转染组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率较IL-1β组明显降低，提示降低STAT-1可能减轻软骨细胞的衰老。

细胞衰老可能涉及多种学说，而细胞端粒长度的缩短是重要机制之一。端粒是真核细胞染色体末端的特殊的DNA/蛋白质复合物，能防止染色体被降解、融合、重组或形成不稳定结构，从而维护染色体的完整性和稳定性[8]。端粒自身则会随着细胞有丝分裂的进行而逐渐缩短。当端粒缩短到一定程度时，染色体就会变得不稳定，细胞就不再分裂，所以端粒缩短是细胞衰老的直接原因[9]。已有研究报道：关节软骨细胞端粒长度的缩短会导致OA的发生发展[10]。端粒的长度调节主要是通过端粒酶来维持，端粒酶是一个自身携带模板的反转录酶，可以延长端粒重复序列，从而使细胞应对分裂后染色体末端缩短问题。本实验进一步应用STAT-1的沉默载体，转染入衰老的关节软骨细胞，检测衰老细胞的端粒酶活性的变化，结果显示，STAT-1转染组细胞端粒酶活性较IL-1β组明显升高，提示STAT-1通过调节端粒酶的活性参与关节软骨细胞衰老的发生。

综上所述，STAT-1在IL-1β诱导的衰老关节软骨细胞中表达升高，转染STAT-1的沉默载体后，软骨细胞的衰老减轻并且端粒酶活性升高。本实验明确STAT-1对衰老的关节软骨细胞的调节效果和可能机制，为进一步阐明关节软骨细胞衰老的分子机制及其防治提供了一条新的思路和靶点。

作者贡献：冯欣进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；冯欣、李垚进行实验实施、评估、资料收集；冯欣进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

参考文献

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[9]Carneiro T，Khair L，Reis CC，et al.Telomeres avoid end detection by severing the checkpoint signal transduction pathway[J].Nature，2010，467(7312)：228-232.

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(本文编辑：贾萌萌)

Influence of STAT-1 on Articular Cartilage Cells Senescence Induced by IL-1β and the Possible Mechanism

FENGXin，LIYao.

DepartmentofRheumatology，theFirstAffiliatedHospitalofLiaoningMedicalUniversity，Jinzhou121000，China

【Abstract】ObjectiveTo study the influence of STAT-1 on articular cartilage cellular senescence induced by IL-1β and the possible mechanism.MethodsAfter the synchronization of articular cartilage cells，they were divided into four groups：normal control group(cartilage cells normally cultured)，IL-1β group (IL-1β was added with an concentration of 10 ng/ml)，negative control group(IL-1β and empty plasmid were added) and STAT-1 transfection group(IL-1β and siRNA-STAT-1 recombinant plasmid were added).The positive rate of β-galactosidase staining of each group was detected；MTT method was adopted to observe the cell proliferation of the four groups at 24，48 and 72 h of cell culture；Western blotting method was used to detect the STAT-1 protein expression of the four groups；telomerase detection kit was used to determine telomerase activity.ResultsAt 24 h of cell culture，the four groups were not significantly different in proliferation level(F=3.037，P=0.087).The four groups were significantly different in the proliferation among each group at 48 h and 72 h of cell culture(F=3.754，P<0.05；F=3.871，P<0.05)；IL-1β group and negative control group were lower than normal control group and STAT-1 transfection group in cell proliferation level(P<0.05).The positive rate of β-galactosidase staining was(12.11±1.34)% for normal control group，(65.62±2.56)% for IL-1β group，(60.73±3.21)% for negative control group and(21.32±2.21)% for STAT-1 transfection group.The four groups were significantly different in the positive rate of β-galactosidase staining(F= 2.877，P<0.05)；IL-1β group and negative control group were higher than normal control group and STAT-1 transfection group in the positive rate(P<0.05).The four groups were significantly different in STAT-1 protein expression level(F=236.150，P<0.05)；IL-1β group and negative control group were higher than normal control group and STAT-1 transfection group in the expression level(P<0.05).The telomerase activity was (81.65±5.28)% for normal control group，(60.32±5.32)% for IL-1β group and(76.76±3.45)% for STAT-1 transfection group.The three groups were significantly different in telomerase activity(F=26.040，P<0.05)；IL-1β group was lower than normal control group and STAT-1 transfection group in telomerase activity(P<0.05).ConclusionThere is higher STAT-1 protein level in the articular cartilage cellular senescence induced by IL-1β.STAT-1 may participate in the articular cartilage cells senescence by influencing telomerase activity.

【Key words】Osteoarthritis；STAT-1；Interleukin-1 β;Telomerase;Cell aging

(收稿日期：2015-10-13；修回日期：2015-12-18)

【中图分类号】R 684.3

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.11.017

通信作者：冯欣，121000辽宁省锦州市，辽宁医学院附属第一医院风湿免疫科；E-mail：xinxinyiran@126.com

基金项目：2015年辽宁省自然科学基金资助项目(2015020356)