L A MP技术在家禽病毒病检测中的应用

宋玉财，李鹏，王彬，王官晓，唐丽华，梁雪，于小川

（1.山东省烟台市动物卫生监督所，山东 烟台 264000；2.烟台市牟平区龙泉镇兽医站，山东 烟台 264112；3.莱阳市畜牧兽医局，山东 烟台 264003）

L A MP技术在家禽病毒病检测中的应用

宋玉财1，李鹏2，王彬1，王官晓1，唐丽华3，梁雪3，于小川1

（1.山东省烟台市动物卫生监督所，山东 烟台 264000；2.烟台市牟平区龙泉镇兽医站，山东 烟台 264112；3.莱阳市畜牧兽医局，山东 烟台 264003）

环介导等温扩增技术（LAMP）是由Notomi等建立的一种核酸扩增技术，该方法最大的优点是能够在63～65℃的等温条件下扩增特定DNA序列,并在30～60min内可以观察到结果。LAMP已经成功用于许多病毒的检测，在本文中，主要概述LAMP技术原理及其在家禽病毒病检测中的应用。

LAMP技术；环介导等温扩增技术；家禽病毒病

1 LAMP技术原理

1.1 LAMP引物相关 LAMP反应需要4条引物，分别针对靶序列上6个不同位置，包括一对外引物F3、B3，另外一对为内引物FIP（Forward inner primer）和BIP（Backward inner primer）。FIP由F1C区和F2区构成，BIP由B1c区和B2区构成[1]。图1为各引物所在位置示意图。

图1 LAMP引物位置示意图

引物设计是LAMP反应成功与否的关键，现在通常使用日本荣研株式会社的在线LAMP引物设计程序 PrimerExplore（http://www.primerexplorer. jp/e/）完成设计工作，Tm值、引物末端稳定性、GC含量、二级结构和引物间距等几个方面都会影响到引物的品质。之后的报道证实在添加一对环状引物后，可缩短大约一半的LAMP反应时间。

1.2 LAMP反应扩增原理 在LAMP反应的开始，FIP引物中的F2片段首先与模板F2c区互补结合，在Bst DNA聚合酶作用下，由模板链的3'端向5'端延伸，而后F3引物与模板的F3c结合，因为Bst DNA聚合酶具有链置换的功能，沿着F3引物扩增出的新链将之前的互补链置换下来。接着BIP引物的B2片段再与这条被置换下的互补链的B2c区结合，过程与之前的F引物相同。一个循环下来就可以得到LAMP反应的起始茎环结构（见图2）。在起始结构形成后，循环便只需要两条内引物参与进行，最终产物是一系列含有不同个数茎环结构的DNA混合物（见图3）。

图2 LAMP反应的起始结构

图3 含不同个数茎环结构的DNA示意

2 LAMP的产物检测

LAMP反应的扩增产物可以通过多种方式来获得验证。首先最基本的，它和PCR产物一样可以通过琼脂糖凝胶电泳的方式，与PCR产物电泳后呈现确定大小的单一条带不同，LAMP产物在凝胶成像系统下呈现出特有的阶梯状条带。但是如果仅仅这样，那LAMP在病原检测方面的优势也就不会那么受人推崇。

第二种，也是最适用于基层临床检测的判断方法，我们可以向LAMP产物中添加SYBR GreenI等核酸染料，当下即能直接通过肉眼来观察结果。以SYBR Green I为例，不扩增的情况反应管内液体为橙红色，而有扩增产物的情况，反应管内的液体则是黄色的。如果肉眼观察还不能肯定结果，只需将反应管置于紫外灯下，在黑暗中呈现明亮荧光的说明模板发生了扩增。

第三，在核酸合成过程中，dNTP不断析出焦磷酸根离子，刚好与体系中的Mg2+作用生成焦磷酸镁沉淀，这本来是副反应的产物，却再次提供了一个肉眼判断结果的方式。LAMP反应完成之后，将反应管离心，如果在管底侧发现白色沉淀，即代表了阳性结果。因为肉眼观察总有误差，2001年日本研制出专用的终点浊度仪来代替肉眼确定结果，此后又设计出了LAMP实时浊度仪，对定量观察反应各时刻的扩增情况提供了条件。

3 LAMP技术在家禽病毒病检测中的应用

LAMP是2000年由日本学者Notomi等人开发出的一种新型体外核酸扩增技术，它能在1h内65℃左右的等温条件下把数拷贝的DNA扩增到至少109拷贝。该报道还验证了LAMP技术同时适用于RNA为模板的情况，添加反转录酶与DNA聚合酶共同作用即可。2002年，Nagamine等发现多增加一对环引物（LF、LB）可以加速LAMP反应进程，其中LF位于模板F1c区和F2c区之间，而LB位于B1c区和B2c区之间[2]。

LAMP技术自发明之后，在动植物病原微生物检测、动物胚胎性别确定以及转基因食品检测等多个方面都开展了进一步的应用。其中在家禽病毒病检测方向，侯佳蕾等[3]根据 GenBank中的H5亚型禽流感病毒(H5-AIV)血凝素基因序列，设计了1套特异识别HA基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物，并以此套引物建立了一种基于LAMP技术的H5亚型禽流感病毒诊断方法。结果表明，该方法对H5-AIVRNA的最小检测限为10-6，灵敏性高于一步RT-PCR方法；全部反应可在 1.5h内完成；在反应体系中添加SYBRGREENⅠ染料后，可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。灵敏性及特异性试验证明，该方法灵敏度高、特异性好，能够作为H5亚型禽流感病毒的快速诊断方法。

罗思思等[4]根据GenBank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的基因保守序列，设计一套环介导等温扩增(LAMP)特异性引物，建立了IBVRT-LAMP可视化检测方法。该法对IBV RNA最小检测限为10fg，而常规RT-PCR为1pg。灵敏度高于常规PCR法100倍。对其他常见鸡病原体检测结果均为阴性。可通过肉眼观察颜色直接判定结果。其建立的IBVRT-LAMP方法简便、快捷、特异、灵敏，且只需一个可控温的水浴锅在1h内即可完成全部反应。更适合基层业务部门及养殖场的检测，为IBV感染的快速检测提供新方法。

鞠小军等选取鸭源新城疫病毒NP基因的相对保守区序列设计特异性引物，并优化了RTLAMP反应体系，能够在63℃下1h内实现目标核酸区域大量扩增。建立的副黏病毒的RT-LAMP检测方法具有快速、准确、特异性强、灵敏度高的特点。Li和Song等根据已公布的鸭甲型肝炎病毒3D基因的保守区域设计引物并优化LAMP各种反应条件，能检测出0.3pg的核酸量。谢丽基等针对鸭甲型肝炎病毒的非编码基因设计4对特异性引物，在61～63℃的水浴中60min即可完成检测过程，并且检测的灵敏度高，是常规RT-PCR的100倍。

尚毅等根据 GenBank中登录的鹅细小病毒（GPV）VP3基因序列，在保守区域设计1套特异识别VP3基因序列中6个不同区段的LAMP引物，建立了一种快速检测GPV的LAMP检测方法，该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。

康忠惠针对禽白血病病毒（ALV）gp85区段设计了两组分别用于检测 A、B亚群禽白血病的LAMP引物，优化反应体系，建立实现了对A、B亚群禽白血病的可视化快速检测。董嘉文等根据GenBank中登录的禽呼肠孤病毒（ARV）S1基因序列，设计了特异对应靶序列中的6个基因区段的4条引物，以此建立了一种快速、准确的ARV RT-LAMP检测方法。

4 小结

LAMP技术是一种新型核酸扩增技术。与其他检测方法相比该方法具有特异性强、灵敏度高、扩增高效、快速、步骤简单、鉴定简便等优点。但LAMP技术的原理较为复杂，特别是引物的设计相当专业；由于敏感性高，假阳性困扰结果的判定；无法做多重扩增；在定量能力方面不如荧光定量PCR等。随着对LAMP研究的深入，该技术将进一步优化、完善，LAMP技术将会在病原微生物，特别是家禽病毒病检测方面发挥越来越重要的作用。

[1] Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loopmediated isothermal amplification of DNA [J]. Nucleic Acids Res,2000,28(12):E63.

[2] Nagamine K,Hase T,NotomiT.Accelerated reaction by loop -mediated isothermal amplification using loop primers [J].Mol Cell Probes.2002,16(3):223-229.

[3] 侯佳蕾，罗开健，樊惠英等.H5亚型禽流感病毒RTLAMP快速检测方法的建立[J].中国兽医科学,2008, 38(12)：1070-1074.

[4] 罗思思，谢芝勋，庞耀珊，等.鸡传染性支气管炎病毒 RT-LAMP可视化检测方法的建立[J].中国农学通报，2012.20.

Application of LAMP technology in poultry virus disease detection

SONG Yu-cai1，LI Peng2，WANG Bin1，WANG Guan-xiao1，TANG Li-hua3，LIANG-Xue3，YU Xiao-chuan1
(1.Yantai Animal Health Authority in Shandong，shandong yantai 264000,China；2.Muping Longquan veterinary station in Yantai，shandong yantai 264112,China；3.Laiyang Animal Husbandry and Veterinary Bureau,，shandong yantai 264003,China；)

Loop-mediated isothermalamplification （LAMP） isan amplification method developed by Notomi et al and has been applied successfully for the detection of many viruses. This paper introduced LAMP technology principle and its application in poultry virus disease detection.

Loop-mediated isothermal amplification;poultry virus disease.

S858.314.4+3

A

1673-1085（2016）04-0053-03

2016-03-16