白介素-4对人气道壁血管平滑肌细胞ADAM 33基因表达的影响研究

张立媛，胡　昕，姚丽丹，王　晶，齐曼古力·吾守尔(新疆医科大学第一附属医院呼吸科，老年病科，乌鲁木齐　80054;昌吉分院，新疆　昌吉　800)



白介素-4对人气道壁血管平滑肌细胞ADAM 33基因表达的影响研究

张立媛1，胡昕1，姚丽丹1，王晶2，齐曼古力·吾守尔3
(新疆医科大学第一附属医院1呼吸科，2老年病科，乌鲁木齐830054;3昌吉分院，新疆昌吉831100)

摘要:目的探讨白介素-4(IL-4)对人气道血管壁平滑肌细胞去整合素金属蛋白酶33(ADAM33)基因表达的影响。方法(1)以0．1、1．0、10、100 ng/mL IL-4刺激培养人气道壁血管平滑肌细胞，用实时定量反转录多聚酶链反应(RT-PCR)法及蛋白印迹法(Western Blot)测定ADAM33基因表达的变化;(2)以100 ng/mL IL-4与人气道壁血管平滑肌细胞共培养，0、6、12、24、48、72 h后，采用RT-PCR及Western Blot法测定ADAM33 mRNA及蛋白表达的变化。结果人气道壁血管平滑肌细胞中存在ADAM33 mRNA的表达，当IL-4刺激浓度增加时，ADAM33 mRNA表达也增加，总体呈现出浓度依赖性趋势;当以100 ng/mL IL-4刺激时，随刺激时间延长，ADAM33mRNA的表达也有增加，总体呈现时间依赖性趋势。结论IL-4能促进人气道壁血管平滑肌细胞ADAM33基因的表达。

关键词:ADAM33;哮喘;平滑肌细胞;气道重塑

人类ADAM33基因mRNA表达信号主要位于平滑肌细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等部位，而在上皮细胞、T淋巴细胞或炎症细胞中表达较少。ADAM33在间充质细胞中的选择性表达，强烈提示其可能与气道重塑有关［1－2］。有研究显示ADAM33参与调节血管生成过程中所必经的细胞增殖、迁移、黏附和/或官腔结构形成等步骤［3－4］。哮喘的发病机制除遗传因素外，Thl/Th2细胞因子表达失衡也是哮喘发病机制之一，Th2细胞因子以白介素-4(IL-4)和白介素-13(IL-13)为代表，IL-4和IL-13可以刺激支气管上皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞释放许多炎症介质和炎症因子，广泛参与气道重塑过程。有关研究显示，应用IL-4或IL-13对培养的肺成纤维细胞进行刺激时，ADAM33 mRNA的表达增加，并呈一定的浓度依赖性［5－8］。

研究显示维吾尔族人群哮喘发病与ADAM33基因突变有关［9－11］。为了明确ADAM33在哮喘患者气道重塑的特征性改变中所起的作用，本研究进一步探索IL-4对人气道壁血管平滑肌细胞ADAM33基因表达的影响。

1　材料与方法

1．1材料人气道壁血管平滑肌细胞来源于明确诊断的维吾尔族支气管哮喘合并肺大泡患者，患肺切除。人重组白介素-4(IL-4)(华美公司)，RPMI-1640干粉培养基、D-Hanks粉、标准胎牛血清、胰蛋白酶粉(1∶250)(HyClone公司)，青霉素钠、硫酸链霉素(华北制药厂)，抗兔平滑肌a肌动蛋白单克隆抗体(Zymed公司)，SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中山生物技术公司)。IL-4 ELISA试剂盒、RNasin试剂盒、DNase试剂盒(TakaRa公司)，LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒、LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green II试剂盒(Roche公司)，蛋白Marker、蛋白预染分子量Marker试剂盒(fermentas公司)，Trizol(Invitrogen公司)，白介素-4 abcam抗体(英国Abcam公司)。

1．2细胞培养活检肺组织经D-hanks液清洗，用眼科剪将组织剪成1mm×1mm大小组织块，放入各含1 mg/mL的胰酶液中，37℃混匀15 min后，980 r/min离心10 min。后用培养基洗1遍，置25 mL的培养瓶中，加入含20%FBS的培养基，37℃、5%CO2培养3～4 h，4～5 d换液，当组织块外围生长的细胞相互汇合时进行首次传代，细胞悬液按1∶2接种，传代周期为5～7 d。倒置相差显微镜下观察细胞形态，进行细胞形态学鉴定，气道壁血管平滑肌细胞呈梭形，有多个细胞突起，细胞生长致密时平行排列成束，表现为典型的“谷峰状”成长。当细胞扩增至2× 106个时，将气道壁血管平滑肌细胞置于6孔板中，每孔约含1×105个细胞，分组给予IL-4刺激。

1．3 RT-PCR实验分组

1．3．1 IL-4刺激浓度与ADAM33 mRNA表达水平的关系IL-4刺激浓度分别为0．1、1、10、100 ng/ mL，空白对照组加入等量的细胞培养液，其中每个浓度均取3个复孔，培养24 h后，提取RNA，比较气道壁血管平滑肌细胞不同IL-4刺激浓度下ADAM33表达的变化。

1．3．2 IL-4刺激时间与ADAM33 mRNA表达水平的关系IL-4与气道壁血管平滑肌细胞共培养，空白对照组加入等量的细胞培养液，实验组IL-4刺激浓度为100 ng/mL，在刺激时间分别为0、6、12、24、48、72 h后结束，每个时间点均取3个复孔，提取RNA，比较气道壁血管平滑肌细胞相同浓度IL-4刺激不同时间时ADAM33表达的变化。

1．3．3 RT-RCR

1．3．3．1 RNA提取及cDNA合成Trizol试剂法提取RNA，进行cDNA合成在0．2 mL PCR管中加入以下试剂:5μL total RNA、1μL Random Primer p (dN)6(0．2μg/μL)、5μL Rnase-free dd H2O，70℃温浴5 min。冰浴10 s，离心加入4．0μL 5×Reaction Buffer、2．0μL dNTP Mix(10 mmol/L)、1．0μL Rnase inhibitor(20 U/μL)、2．0μL AMV Reverse Transcriptase(10 U/μL)20．0μL Total volume，37℃温浴5 min，42℃温浴60 min，70℃温浴10 min，终止反应。将上述溶液－20℃保存。

1．3．3．2实时定量PCR分析管家基因(GAPDH)引物序列:F:5'-TGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3'，57．4 bp，R:5'-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3'57．9 126 bp，ADAM33引物序列:F:5'-GATACATAGAAACCCACTACGGC-3'57．8bp R:5'-CCCTTGGTAGTGGCAATGAT-3'57．3 83 bp。反应混悬液的配制:cDNA模板2μL、引物0．7μL、250mmol/LMgCl20．3μL、10mmol/L dNTP0．75μL、FCD1μL、2×SYBR Green I液2．5μL、5×real time PCR buffer 5μL、H2O 12．5μL。上述样品经95℃变性2 min后，按照95℃10 s，60℃40s，共进行40个循环。把加好样的孔板放在荧光定量PCR仪中进行反应，收集荧光信号。实时定量PCR结果由荧光定量分析仪自动采集给出目的基因和参比基因的CT值，采用实验组/对照组=2－△△CT计算基因表达量，其中△△CT=(CT目的－CT参比)实验－(CT目的－CT参比)对照，可以用来评价不同浓度刺激因子对人气道壁血管平滑肌细胞ADAM33基因表达的影响。2－△△CT表示实验组较对照组ADAM33基因表达增加的倍数。在RTPCR循环结束后，绘制溶解曲线判断扩增产物的特异性，如曲线无峰值出现，均视为阴性结果。

1．4 Western blot实验分组

1．4．1 IL-4刺激浓度与ADAM33蛋白表达水平的关系IL-4刺激浓度分别为0．1、1、10、100 ng/mL，空白对照组加入等量的细胞培养液，其中每个浓度均取3个复孔，加药24 h后提取总蛋白，行蛋白印迹实验(Western blot实验)，比较气道壁血管平滑肌细胞不同IL-4刺激浓度下ADAM33蛋白表达的变化。

1．4．2 IL-4刺激时间与ADAM33蛋白表达水平的关系IL-4与气道壁血管平滑肌细胞共培养，空白对照组加入等量的细胞培养液，实验组IL-4刺激浓度为100 ng/mL，在刺激时间分别为0、6、12、24、48、72 h后结束试验，加药后分别于0、6、12、24、48、72 h后提取总蛋白，行蛋白印迹实验(Western blot实验)，比较气道壁血管平滑肌细胞相同浓度IL-4刺激不同时间时ADAM33蛋白表达的变化，

1．4．3气道壁血管平滑肌细胞总蛋白提取及Western blot检测ADAM 33蛋白的表达水平

IL-4与气道壁血管平滑肌细胞共培养后，分别洗出培养液，加入2 m L预冷的PBS，洗涤细胞，弃去PBS，重复洗涤2～3遍，将培养瓶置于冰上;1 m L RIPA裂解液与10μL PMSF混匀，取400μL加入细胞瓶中，混匀后置于冰上30 min，细胞充分裂解后，4℃、12 000 r/min离心12 m in，弃去上清;采用BCA蛋白定量法测定提取蛋白的浓度，操作严格按照BCA蛋白定量Kit说明书，每个药品终浓度均调整为2μg/μL，－80℃保存。制备聚丙烯酰胺凝胶，每个样品取相同总蛋白量，加入相同体积2×loading buffer上样缓冲液，混匀沸水浴煮5 m in，4℃存放备用，用微量加样器加样，每孔加入50μg的蛋白样品;60 V电压，电泳30 m in，分离胶用120 V的电压电泳90 min，待溴酚兰电泳至底端时停止电泳，进行转膜，转膜后进行免疫杂交显色，经凝胶成像分析系统分析条带光密度，根据光密度值大小得出各组相对表达量的值。

1．5统计学处理采用SPSS19．0统计软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差(±s)表示;多组计量资料间比较采用one-way ANOVA分析，两组间比较采用LSD-t检验，P＜0．05表示差异有统计学意义。

2　结果

2．1 RT-PCR产物确定分析ADAM33基因RTPCR产物融解曲线(图1)，峰值在87．0℃，融解温度均一，曲线峰形状较锋利，具有一定特异性。经聚丙烯酰胺凝胶电泳所得产物均一，为目的条带(图2)。

图1　ADAM 33基因融解曲线

图2　聚丙烯酰胺凝胶电泳所得条带

2．2不同浓度IL-4刺激后ADAM 33基因的表达以0．1 ng/mL IL-4刺激时，人气道壁血管平滑肌细胞ADAM33的表达较空白对照组略有降低，但差异无统计学意义(P＞0．05)，当刺激浓度分别为1、10、100 ng/mL时，ADAM33 mRNA的表达较空白对照组分别增加了(1．51±0．10)倍(P＜0．01)、(1．15±0．14)倍(P＜0．05)、(1．22±0．07)倍(P＜0．05)，差异有统计学意义(图3)。在IL-4刺激浓度分别为0．1、1、10、100 ng/mL时，ADAM33蛋白的相对表达量分别为(0．488±0．183)、(0．537±0．073)、(0．634±0．098)、(0．805±0．024)、(0．854±0．015)(图4)，各组与空白对照组相比，ADAM33蛋白条带灰度逐渐升高(图5)，ADAM33蛋白的相对表达量均有提高，且差异有统计学意义，组内及组间差异有统计学意义(P＜0．05)。

2．3 IL-4与人气道壁血管平滑肌细胞共培养不同时间后ADAM 33基因的表达以IL-4 100 ng/m L刺激人气道壁血管平滑肌细胞，当刺激时间分别为6、12、24、48、72 h时的ADAM 33 mRNA表达较0 h ADAM 33 mRNA的表达分别增加了(0．40±0．053)倍、(0．40±0．026)倍、(1．04±0．263)倍、(1．02±0．132)倍、(1．45±0．105)倍，差异有统计学意义。虽然48 h刺激组较24 h刺激组有所下降，但仍高于0 h刺激组，差异有统计学意义(P＜0．05)(图6)。蛋白印迹检测结果:在IL-4刺激时间分别为0、6、12、24、48、72 h时，ADAM 33蛋白条带浓度逐渐升高，其相对表达量分别为(0．868±0．316)、(1．211±0．211)、(1．158±0．368)、(1．368±0．158)、(1．605±0．263)、(1．474±0．105)(图7)，各组与空白对照组相比，ADAM 33蛋白的相对表达量均有所增加，且差异有统计学意义(P ＜0．05)(图8)。

图3　不同浓度IL-4对人气道壁血管平滑肌细胞ADAM 33mRNA表达的影响

图4　不同浓度IL-4对人气道壁血管平滑肌细胞ADAM 33蛋白表达的影响

图5　不同IL-4刺激浓度，ADAM 33蛋白条带变化

图6　IL-4与人气道壁血管平滑肌细胞共培养不同时间后ADAM 33 mRNA的表达

图7　IL-4与人气道壁血管平滑肌细胞共培养不同时间后ADAM 33蛋白表达

图8　100 ng/m L IL-4刺激不同时间后，ADAM 33蛋白条带变化

3　讨论

目前ADAM33已被学术界公认为哮喘的易感基因，与气道高反应性及气道重塑密切相关，然而ADAM33作为哮喘的易感基因，在间充质细胞中选择性表达，说明其活性改变可能会导致气道平滑肌细胞和成纤维细胞的功能异常［12－14］，Hollowly等［15］和Campo等［16］推测ADAM33基因可能与其他金属蛋白酶一样，可以分解细胞为外基质组分，进而参与气道重塑;ADAM33金属蛋白酶可以促使与膜结合的生长因子及其受体以可溶性形式释放，进而刺激间质细胞增殖、分化;ADAM33基因可能与成纤维细胞相结合，以增加其流动性，提示ADAM33基因参与了哮喘的气道重塑。

Jie等［17］通过建立过敏性慢性气道炎症的小鼠模型，发现致敏小鼠肺组织中ADAM33呈高表达，同时体外细胞学试验证明了IL-4、IL-13可明显上调人类肺成纤维细胞中ADAM33 mRNA的表达，提示ADAM33的过表达可能与辅助性T细胞因子有关。Haitchi等［18］通过研究孕产妇哮喘患者时发现:过敏环境可能会影响人肺发育过程中ADAM33基因的表达，ADAM33 mRNA在人胎肺的假腺管型时期即可被检测到，而在受孕7～9 w有明显上升趋势，体外胎肺组织与IL-13共培养时，ADAM33 mRNA表达受抑制。Ito等［19］研究表明，ADAM33在哮喘患者原代培养的气道平滑肌细胞中表达显著增高，给予一定量的Thl型细胞因子(IFN-γ)干预后可明显抑制ADAM33基因的表达，提示IFN-γ可以调节哮喘患者气道平滑肌细胞中ADAM33的表达。上述研究均提示辅助性T细胞因子在哮喘的发病中起着不可忽视的作用，且与ADAM33基因的过表达之间存在一定关系。

气道重塑不仅包括气道结构重塑，还包括了气道血管的重塑，而气道血管的重塑又以气道壁血管平滑肌细胞的增生为主。目前对于气道壁血管平滑肌细胞的增生与ADAM33基因的过表达及IL-4之间有何关系，尚不清楚。本研究发现人气道壁血管平滑肌细胞中有ADAM33基因的表达，同时分别采用RT-PCR及蛋白印迹实验测定了ADAM33基因及蛋白的表达。当用不同浓度IL-4刺激人气道壁血管平滑肌细胞时，ADAM33基因表达有上调趋势，同时随着刺激时间的延长，ADAM33基因表达亦有上调趋势。

综上，本研究认为在哮喘患者气道壁血管平滑肌细胞中存在ADAM33基因的表达，且IL-4可以促进该基因的表达，ADAM33基因可能参与了哮喘患者气道血管的重塑，且IL-4在上述过程中上调了ADAM33基因的表达，但是IL-4是通过何种途径促进ADAM33基因表达上调的尚需进一步研究。

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(本文编辑杨晨晨)

The effect of interleukin-4 on ADAM 33 gene expression in airway wall vascular smooth muscle cells

ZHANG Liyuan1，HU Xin1，YAO Lidan1，WANG Jing2，QimanguliW ushouer3
(Department of1Respiratory Medicine，2Department of Geratology，the First Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi830054，China;3Changji Branch，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Changji831100，China)

Abstract:Objective To study the effectof IL-4 on ADAM33 gene expression in airwaywall vascular smoothmuscle cells．M ethods Human airway wall vascular smoothmuscle cellswere cultured and stimulated with 0．1，1．0，10 and 100 ng/mL IL-4．The expression of ADAM33 mRNA was evaluated by RT-PCR and its protein was evaluated by Western blotting．Results ADAM33mRNA was expressed in airway wall vascular smoothmuscle cells．IL-4 enhanced ADAM33 gene expression in airway wall vascular smoothmuscle cells in a dose and time-dependent(IL-4 was at100 ng/mL)manner．Conclusion Itwas suggested that ADAM33 genewas expressed on airway wall vascular smooth muscle cells and IL-4 could enhance ADAM33 expression．

Key words:a disintegrin and metalloproteinase 33 gene;asthma;vascular smoothmuscle cells;airway remodeling

［收稿日期:2015-12-06］

通信作者:王晶，女，副教授，硕士生导师，研究方向:支气管哮喘，E-mail:tlfwj@163．com。 齐曼古力·吾守尔，女(维吾尔族)，主任医师，教授，博士生导师，研究方向:支气管哮喘的临床应用与基础研究，E-mail:qimenw@hotmail．com。

作者简介:张立媛(1988－)，女，在读硕士，研究方向:支气管哮喘。

基金项目:国家自然科学基金(81160004，81100026)

doi:10．3969/j．issn．1009-5551．2016．03．003

中图分类号:R562;Q344

文献标识码:A

文章编号:1009-5551(2016)03-0265-05