补肾安胎冲剂对复发性自然流产小鼠蜕膜血管内皮生长因子及其受体调控作用研究

储继军，李伟莉，吴献群，秦秀娟

(1.湖北中医药大学中医临床学院，湖北 武汉　430061；2. 安徽中医药大学第一附属医院妇科，安徽 合肥　230031；3. 湖北中医药大学附属医院妇产科，湖北 武汉　430061；4.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥　230038)



补肾安胎冲剂对复发性自然流产小鼠蜕膜血管内皮生长因子及其受体调控作用研究

储继军1,2，李伟莉2，吴献群3，秦秀娟4

(1.湖北中医药大学中医临床学院，湖北 武汉430061；2. 安徽中医药大学第一附属医院妇科，安徽 合肥230031；3. 湖北中医药大学附属医院妇产科，湖北 武汉430061；4.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥230038)

[摘要]目的观察补肾安胎冲剂对复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)小鼠胚胎丢失率和蜕膜组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体的影响。方法采用Clark经典RSA小鼠模型，将RSA小鼠随机分为模型组、补肾安胎冲剂低剂量(11.7 g/kg)组、补肾安胎冲剂高剂量(23.4 g/kg)组，黄体酮胶囊(156 mg/kg)组，另取正常妊娠小鼠作为正常组，每组8只。末次给药后，处死小鼠，计算胚胎丢失率；光镜下观察蜕膜组织血管形态学改变；采用免疫组化法检测蜕膜组织VEGF、血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)、可溶性血管内皮生长因子受体-1(soluble vascular endothelial growth factor receptor 1，sVEGFR-1)的表达；采用RT-PCR法检测小鼠蜕膜组织中VEGF、VEGFR-2及sVEGFR-1 mRNA的表达。结果补肾安胎冲剂能改善蜕膜组织血管形态学变化，升高蜕膜组织中VEGF和VEGFR-2蛋白含量，降低sVEGFR-1蛋白含量；能显著降低RSA小鼠胚胎丢失率(P<0.05)，升高蜕膜组织中VEGF和VEGFR-2 mRNA表达水平，降低sVEGFR-1 mRNA表达水平(P<0.05)，呈现明显的量效关系。结论补肾安胎冲剂对RSA小鼠具有一定的保护作用，其机制可能与调控VEGF及其受体，改善蜕膜组织血管重铸有关。

[关键词]复发性自然流产；补肾安胎冲剂；血管内皮细胞生长因子；血管重铸

复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)，中医称为滑胎，是妊娠期最常见的并发症之一，其发生率约占育龄妇女的1%～2%，占所有妊娠丢失的15%～20%[1]。RSA发病原因复杂[2-3]，西医疗效尚待提高。补肾安胎冲剂是安徽中医药大学第一附属医院根据“肾主生殖”和“胞胎系于肾”理论，结合多年临床实践创制的特色中药制剂，具有补肾健脾益气安胎的作用，临床疗效确切[4-6]。本实验通过复制RSA模型观察补肾安胎冲剂对RSA小鼠的治疗作用，并探讨其可能机制。

1材料

1.1药材与试剂补肾安胎冲剂(批号：皖药制字BZ20080017)：由菟丝子、桑寄生、续断、熟地黄、炒白术、白芍、党参、炙黄芪、黄芩等组成，由安徽中医药大学第一附属医院制剂室提供；黄体酮胶囊(每粒50 mg，批号为国药准字H20041902)：由浙江仙琚制药股份有限公司提供；逆转录试剂盒(Revert Aid TM first Strand cDNA Synthesis Kit)(批号 00221108)：由Thermo公司提供；血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗体(批号 E8562)：由Santa Cruz公司提供；血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)抗体(批号 4)：由Cell Signaling Technology提供；可溶性血管内皮生长因子受体-1(soluble vascular endothelial growth factor receptor 1，sVEGFR-1)抗体(批号 CJ36131)：由Bioworld公司提供。VEGF、VEGFR-2和sVEGFR-1检测试剂盒均购于北京中杉公司。

1.2动物雌性CBA/J小鼠50只、雄性DBA/2小鼠20只及BALB/c小鼠5只，SPF级，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，生产许可证号：SCXK[京]2014-0004。

1.3仪器JB-P5 包埋机，由湖北省武汉俊杰电子有限公司提供；RM2016病理切片机，由上海莱卡仪器有限公司提供；PIKOREAL 96荧光定量PCR仪，由赛默飞世尔科技公司提供。

2方法

2.1RSA小鼠模型的复制按Clark经典RSA小鼠模型复制方法[7]，将雌性CBA/J小鼠与雄性DBA/2小鼠按2∶1合笼交配，复制RSA模型；将雌性CBA/J小鼠与雄性BALB/c小鼠按2∶1合笼交配，复制正常妊娠小鼠。检出阴栓者计为妊娠第0天。

2.2分组及给药将上述RSA模型小鼠随机分为4组：模型组，补肾安胎冲剂低剂量(11.7 g/kg，相当于60 kg成人临床剂量3倍)组，补肾安胎冲剂高剂量(23.4 g/kg)组，黄体酮胶囊(156 mg/kg)组，每组8只，另取正常妊娠小鼠8只作为正常组。于检出阴栓第2天开始，除模型组及正常妊娠组小鼠接受同容积蒸馏水灌胃外，其余3组小鼠每天接受相应药物灌胃(20 mL/kg)，每日1次，连续给药15 d。

2.3检测指标

2.3.1胚胎丢失率观察末次给药24 h后，处死小鼠，剖视子宫观察胚胎丢失情况，具体判断标准参考文献[8]。正常胚胎粗大状如串珠，宫内尚未发现痕血，胚胎呈现淡红色；流产胚胎的宫内可见明显痕血，胚胎颜色呈黑褐色，或子宫呈现竹节样改变，胚胎出现完全或部分消失。胚胎丢失率=丢失胚胎数/(丢失胚胎数+存活胚胎数)。

2.3.2蜕膜组织血管形态学观察取固定部位蜕膜组织，置于4%多聚甲醛液中固定、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，普通光学显微镜下观察蜕膜组织血管形态学改变。

2.3.3免疫组化法检测蜕膜组织VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1的分布及表达参照免疫组化检测试剂盒和DAB酶底物显色试剂盒的说明书进行操作，即石蜡切片(厚度2 μm)，脱蜡至水，抗原微波修复后，加一抗、二抗孵育，显色、衬染、中性树胶封片，光学显微镜下观察蜕膜组织切片，以细胞浆或细胞核内的棕黄色粗颗粒或棕黄色细腻颗粒弥漫分布为阳性表达。

2.3.4RT-PCR检测蜕膜组织VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1 mRNA的含量取小鼠蜕膜组织100 mg，采用TRIzol法抽提小鼠蜕膜组织中总RNA，总反应体系10 μL，合成cDNA。取逆转录产物1 μL作为反应模板，反应体系10 μL。VEGF引物序列：正向引物为5′- CTCTCTCCCAGATCGGTGAC-3′，反向引物为5′-CAAAGGAATGTGTGGTGGGG-3′；VEGFR-2引物序列：正向引物为5′- ACAGTTCCCAGAGTGGTTGG-3′，反向引物为5′-GTCACTGACAGAGGCGTAGA-3′；sVEGFR-1引物序列：正向引物为5′- CAGACAATTCTGCAGCACCT-3′,反向引物为5′-TCCTTCGAGGTGGATTTAGG-3′；β-actin引物序列：正向引物为5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反向引物为5′- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。扩增条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸10 s，40个循环，反应结束后，由电脑软件自动分析读取CT值，使用相对定量研究方法进行分析。

3 结果

3.1补肾安胎冲剂对RSA小鼠胚胎丢失率的影响模型组小鼠胚胎丢失率较正常组显著升高(P<0.05)；模型组和补肾安胎冲剂高、低剂量组小鼠胚胎丢失率比较，差异具有统计学意义(F(2，21)=55.32，P=0.000)，提示补肾安胎冲剂在降低RSA小鼠胚胎丢失率方面具有明显的量效关系，以补肾安胎冲剂高剂量的效应最为显著；黄体酮胶囊组和补肾安胎冲剂高、低剂量组小鼠胚胎丢失率比较，差异具有统计学意义(F(2，21)=16.04，P=0.000)，黄体酮胶囊降低RSA小鼠胚胎丢失率的效应与补肾安胎冲剂高剂量组相当。见表1。

表1　各组小鼠胚胎丢失率比较±s)

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与补肾安胎冲剂低剂量组比较，△P<0.05。

3.2补肾安胎冲剂对RSA小鼠蜕膜组织血管形态学影响与正常妊娠小鼠比较，模型组RSA小鼠绒毛大小不一，形态不规则，合体滋养层细胞及细胞滋养层细胞均明显减少，萎缩变性，排列紊乱，可见凋亡细胞及炎性细胞，核固缩，染色较深，间充质及基质见纤维素样变性，间质血管减少；蜕膜组织变性，上皮不完整，细胞排列不规则，腺体皱缩，血管瘀血。给予补肾安胎冲剂和黄体酮胶囊干预后，RSA小鼠蜕膜组织血管形态学呈现好转趋势。结果见图1。

注:A.正常组;B.模型组;C.补肾安胎冲剂低剂量组;D.补肾安胎冲剂高剂量组;E.黄体酮胶囊组;白色箭头示蜕膜组织血管。

图1各组小鼠蜕膜组织形态学变化(HE染色，10×20倍)

3.3补肾安胎冲剂对RSA小鼠蜕膜组织中VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1分布及表达的影响在各组小鼠蜕膜中，VEGF主要表达于蜕膜细胞、腺上皮细胞和血管内皮细胞胞浆中，细胞核未见明显着色，蜕膜细胞阳性染色强，见图2；VEGFR-2在蜕膜组织的阳性表达位于大部分蜕膜细胞及少数腺上皮细胞的胞核和胞浆内，见图3；sVEGFR-1在血管内皮细胞中存在丰富的表达，见图4。模型组RSA小鼠VEGF、VEGFR-2的表达低于正常组，补肾安胎冲剂低、高剂量组及黄体酮胶囊组，而sVEGFR-1的表达高于正常组，补肾安胎冲剂低、高剂量组及黄体酮胶囊组。

3.4补肾安胎冲剂对RSA小鼠蜕膜组织中VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1 mRNA表达的影响与正常妊娠小鼠比较，模型组小鼠蜕膜组织中VEGF mRNA和VEGFR-2 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，sVEGFR-1 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。模型组和补肾安胎冲剂高、低剂量组小鼠蜕膜组织中VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA和sVEGFR-1 mRNA表达水平比较，差异均具有统计学意义(VEGF mRNA：F(2，15)=85.56，P=0.000；VEGFR-2 mRNA：F(2，15)=68.35，P=0.000；sVEGFR-1 mRNA：F(2，15)=9.33，P=0.002)，以补肾安胎冲剂高剂量升高VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA表达水平和降低sVEGFR-1 mRNA表达水平的效应最显著。黄体酮胶囊组和补肾安胎冲剂高、低剂量组小鼠蜕膜组织中VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA和sVEGFR-1 mRNA表达水平比较，差异均具有统计学意义(VEGF mRNA：F(2，15)=11.21，P=0.001；VEGFR-2 mRNA：F(2，15)=14.83，P=0.000；sVEGFR-1 mRNA：F(2，15)=18.71，P=0.000)，以黄体酮胶囊升高VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA表达水平和降低sVEGFR-1 mRNA表达水平的效应最显著。见图5。

注:A.正常组;B.模型组;C.补肾安胎冲剂低剂量组;D.补肾安胎冲剂高剂量组;E.黄体酮胶囊组;白色箭头示棕黄色的VEGF蛋白。

图2　各组小鼠VEGF的表达情况(10×20倍)

图3各组小鼠VEGFR-2的表达情况(10×20倍)

4讨论

RSA属中医学“滑胎”范畴。肾气不足致胎失所系，脾虚血少致胎失所养等，均可导致胎元不固而殒堕[9]。补肾安胎冲剂是安徽中医药大学第一附属医院根据“肾主生殖”“胞胎系于肾”理论，经过多年临床验证形成的中药制剂，具有补肾健脾、益气安胎的功效[10]。方中菟丝子补肾益精为全方主药；续断既补肝肾，又具止血安胎之功效；桑寄生有补肝肾、养血安胎之功；熟地黄滋阴补肾、益精养血；党参、黄芪补脾益肾，即能补脾肾之气，又兼固精之效；黄芩清热止血安胎，与白术配伍使用，有朱丹溪“安胎圣药”之妙。全方紧紧围绕滑胎“肾脾亏虚”的核心病机，补肾以养先天，使肾系有力、胎元得固；健脾以益后天，使气血生化有源、胎元得养。

注:A.正常组;B.模型组;C.补肾安胎冲剂低剂量组;D.补肾安胎冲剂高剂量组;E.黄体酮胶囊组;白色箭头示棕黄色的sVEGFR-1蛋白。

图4各组小鼠sVEGFR-1的表达情况(10×20倍)

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与补肾安胎冲剂低剂量组比较，△P<0.05；与补肾安胎冲剂高剂量组比较，◇P<0.05。

图5各组小鼠VEGF、VEGFR-2和sVEGFR-1 mRNA

在妊娠过程中，胎盘微血管的生成及胎盘血管网络的构建是至关重要的[11]，血管建立在胎盘与子宫内膜之间，并侵入蜕膜组织，血管新生及其通透性改变在胚胎着床到胎盘形成中发挥着重要作用[9]。VEGF是一种主要的血管生成和血管通透性诱导因子[12]，既有促进微小静脉通透性增加，促进血管内皮细胞分裂和增殖，使细胞钙聚集等作用，又可诱导血管生成，参与母胎界面血管重铸[13]。妊娠时期原始血管形成，主要来源于内皮细胞的VEGF通过与其特异性受体VEGFR-2结合而促进细胞侵袭蜕膜组织，完成血管重铸过程[14]。VEGFR-2具有很强的酪氨酸激酶活性，介导了VEGF的主要作用。本实验结果表明，模型组RSA小鼠VEGF和VEGFR-2的表达较正常妊娠小鼠显著降低，与文献报道[15]一致。与模型组RSA小鼠比较，补肾安胎冲剂低、高剂量组及黄体酮胶囊组均可不同程度增加小鼠蜕膜组织中VEGF和VEGFR-2的表达，并且明显减少小鼠的胚胎丢失率。

sVEGFR-1是VEGFR-1的可溶性形式，能与膜表面受体竞争结合VEGF，起着天然的内源性血管生成抑制剂作用，阻断VEGF促血管生成的信号转导通路，从而抑制VEGF诱导血管生成的生物学活性[16]。Ahmad等[17]也观察到来自正常妊娠绒毛的条件培养液促进内皮细胞迁移、管状形成，加入外源性sVEGFR-1则削弱其作用，导致流产的发生。本实验结果显示，模型组RSA小鼠sVEGFR-1的表达较正常妊娠小鼠明显升高，补肾安胎冲剂低、高剂量组可不同程度降低小鼠蜕膜组织中sVEGFR-1的表达。

综上所述，补肾安胎冲剂对RSA小鼠蜕膜组织中血管生成具有一定的促进作用，其机制可能是通过升高RSA小鼠蜕膜组织中VEGF和VEGFR-2的含量，降低sVEGFR-1的含量，从而促进小鼠蜕膜组织中血管生成，保护妊娠。

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Regulatory Effect of Granule for Tonifying the Kidney and Preventing Miscarriage on Decidual Vascular Endothelial Growth Factor and Its Receptor in Mice with Recurrent Spontaneous Abortion

CHUJi-jun1,2,LIWei-li2,WUXian-qun3,QINXiu-juan4

(1.CollegeofClinicalChineseMedicine,HubeiUniversityofChineseMedicine,HubeiWuhan430061,China; 2.DepartmentofGynecology,TheFirstHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031;3.DepartmentofObstetricsandGynecology,TheAffiliatedHospitalofHubeiUniversityofChineseMedicine,HubeiWuhan430061;4.GraduateDivision,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of Granules for Tonifying the Kidney and Preventing Miscarriage(GTKPM)on embryo loss rate and decidual vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor in mice with recurrent spontaneous abortion (RSA). MethodsThe classical Clark RSA mice were selected and randomly divided into model group, low-dose GTKPM group (11.7 g/kg), high-dose GTKPM group (23.4 g/kg), and progesterone capsule group (156 mg/kg), each with 8 mice. Another 8 normal pregnancy mice were selected as the control group. After the last administration, the mice were sacrificed, and the embryo loss rate (ELR) was calculated. The changes in the vascular morphology of decidual tissue were observed under a light microscope. The protein expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2), and soluble vascular endothelial growth factor receptor 1 (sVEGFR-1) in decidual tissue was measured by immunohistochemistry. Moreover, RT-PCR was performed to measure the mRNA expression of VEGF, VEGFR-2, and sVEGFR-1 in decidual tissue. ResultsGTKPM improved the vascular morphology of decidual tissue, increased the protein expression of VEGF and VEGFR-2 in decidual tissue, and reduced the protein expression of sVEGFR-1. In addition, GTKPM significantly reduced the ELR of RSA mice (P<0.05), increased the mRNA expression of VEGF and VEGFR-2 in decidual tissue, and reduced the mRNA expression of sVEGFR-1 (P<0.05),with a significant dose-effect relationship. ConclusionGTKPM has a certain protective effect on RSA mice, which may be related to its regulatory effect on VEGF and its receptor and improving the vascular remodeling of decidual tissue.

[Key words]Recurrent spontaneous abortion; Granule for Tonifying the Kidney and Preventing Miscarriage; Vascular endothelial growth factor; Vascular remodeling

(收稿日期：2016-01-20；编辑：姚实林)

[中图分类号]R285.5；R714.21[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.023

通信作者：吴献群，foursides@163.com

作者简介：储继军(1977-)，男，博士研究生，主治医师