RAGE基因多态性与阿尔茨海默病在中国汉族人群中的相关性研究

黄　通，温　琪，王长义，彭晓琳，张春惠，刘盛元，李克深

(1.深圳市南山区慢性病防治院，广东 深圳　518054；2.广东省衰老相关疾病重点实验室，广东 湛江　524001)



临床医学研究

RAGE基因多态性与阿尔茨海默病在中国汉族人群中的相关性研究

黄通1，温琪1，王长义1，彭晓琳1，张春惠1，刘盛元1，李克深2

(1.深圳市南山区慢性病防治院，广东 深圳518054；2.广东省衰老相关疾病重点实验室，广东 湛江524001)

[摘要]目的 探讨在中国汉族人群中晚期糖基化终末产物受体基因多态性与阿尔茨海默病发生的关系。方法 采用病例-对照设计，确定70例AD患者和67例对照进行研究，对受试者外周静脉血提取全血DNA，通过PSTAR-II plus(IDN01-M-P2)高通量测序的方法检测两组样本RAGE基因多态性，比较其基因型的分布情况。结果 rs1800624位点的多态性差异具有统计学意义，AD组AA基因型频率(50%)和A等位基因频率(61.43%)分别明显高于对照组的(1.49%)和(13.43%)，AA基因型患AD的风险是AT基因型的34.994倍(OR=34.994，95%CI：4.264～287.179)；AA和AT基因型患AD的风险分别是TT基因型的92.089倍(OR=92.089，95%CI：11.777～720.070)和2.632倍(OR=2.632，95%CI：1.101～6.290)；有A等位基因能够明显增加AD的发病风险(OR=7.895，95%CI：3.686～16.911)；rs1800625位点的多态性差异无统计学意义。结论 在中国汉族人群中，rs1800624位点与AD的发生相关，A等位基因可能是AD发生的危险因素。

[关键词]阿尔茨海默病；晚期糖基化终末产物受体；单核甘酸多态性

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种以进行性认知功能障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为渐进性记忆障碍和认知功能障碍，并伴有各种神经精神症状和行为能力减退，是痴呆最常见的类型[1]。2010年全球约有AD患者3500万，到2050年将达到1.15亿[2]。AD发病率高、患病率高、致残率高的特点是其成为全球关注的公共卫生问题[3]。探讨AD发病机理和影响因素，对早期发现易患人群给予重点防治，提高老年人生活质量，减轻社会负担具有重要意义。

晚期糖基化终末产物(Receptor for advanced glycation end products，RAGE)受体属于免疫球蛋白家族。中枢神经系统内，RAGE主要在神经元、小胶质细胞以及血管内皮细胞上表达，同时RAGE可以与多种与AD有关的分子(β-淀粉样蛋白、晚期糖基化终末产物和S100/钙粒蛋白)结合[4-5]，说明RAGE在AD的病理发生中发挥了重要的作用，但是目前没有研究报道从分子流行病学角度阐述RAGE基因rs1800624和rs1800625位点多态性与AD的关系，因此本文探讨了其与AD的关联性，为临床诊断和治疗AD提供理论依据。

1对象与方法

1.1研究对象纳入与排除标准AD患者均经过标准检查，包括详细的病史采集、全面体格检查以及神经系统检查、实验室筛查实验、认知功能评估、头部核磁共振成像或CT检查，从深圳市福田区人民医院和石岩敬老院选取符合精神疾病诊断与统计手册(DSM-IV)和美国国立神经病、语言交流障碍和卒中研究所—老年性痴呆及相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)标准[6]的单纯AD病例。

排除标准：有血管性和“混合”老年痴呆症、神经性疾病、癌症、糖尿病、高血压和心脑血管疾病的对象均被排除在外。同时，在深圳市福田区人民医院和石岩敬老院中选取临床、心理和神经学评估均正常的人作为对照组，以上所有研究对象均为汉族。该项研究已得到伦理委员会批准，研究人员对每个入选对象都要进行详细的研究说明并由入选对象签署一份书面的知情同意书。

1.2实验研究方法

1.2.1基因组DNA的提取将200 μL EDTA-K2抗凝全血于3 000 rpm离心20 min，弃去血浆，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)试剂盒使用说明书提取基因组DNA，取5 μL提取产物进行0.7%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL溴化乙锭)电泳鉴定，以DNA Marker DL2000作为DNA分子量标准，在紫外灯下观察产物电泳结果，其余置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2基因型的检测RAGE基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点选择标准：①公开发表文献和数据库中的SNPs位点；②在流行病学研究中报道过的与疾病相关的SNPs位点；③SNPs位点的次要等位基因频率>0.1。根据以上标准，本文选择了位于RAGE基因启动子区域的rs1800624和rs1800625两个SNP位点进行研究。应用Primer premier 5引物设计软件在多态性位点附近100bp左右区域设计引物，将其序列在NCBI数据库中进行比对，确定引物特异性，最后引物序列由深圳华因康公司合成。

PCR扩增反应体系：2 X Taq Unicorn Premix 10 μL，引物P1、P2各0.3 μL(10 μmol/L)，基因组DNA模板1 μL(25 ng/μL)，ddH2O 8.4 μL，共20 μL体系。PCR反应条件如下：94 ℃变性4 min，1个循环；94 ℃变性20 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，20个循环；72 ℃继续延伸3 min，最后置于4 ℃终止反应。扩增完毕后，为了获取大量目的片段取1 μL PCR扩增产物，稀释10倍后作为反应模板，再行另一次PCR扩增，除模板PCR扩增反应体系同上。以上2次PCR产物取5μL加入上样缓冲液1 μL，180 V电压12%PAGE凝胶电泳20 min，紫外成像仪检测电泳结果并拍照。对扩增的片段中的单核苷酸多态性采用PSTAR-II plus(IDN01-M-P2)高通量测序的方法检测。

2结果

2.1一般情况AD组共有70例，其中男性42(60%)例，女性28(40%)例，年龄为75.5(68，78)岁；对照组共有67例，其中男性32(47.76%)例，女性35(52.24%)例，年龄为72(68，76)岁，年龄和性别构成在两组间差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(见表1)。

表1AD组和对照组的年龄和性别情况

组别例数年龄(岁)性别(男/女)AD组7075.5(68,78)42/28健康对照组6772.0(68,76)32/35P0.17150.1508

2.2rs1800624和rs1800625位点的HWE检验和连锁不平衡分析rs1800624和rs1800625位点的HWE检验结果显示，两位点在对照组中的基因型频率均符合HWE，只有rs1800624位点在AD组中的基因型频率不符合HWE，表明AD组可能发生了明显的rs1800624位点突变(见表2)。

两位点的连锁不平衡分析结果为χ2=3.579 0，P=0.058 5，表明两位点之间不存在连锁不平衡关系，彼此相对独立。

表2rs1800624和rs1800625位点的HWE检验结果

分组SNPIDChi-SquareDFPAD组rs180062418.75781<0.0001rs18006252.234510.1350对照组rs18006240.048210.8262rs18006250.038910.8437

2.3rs1800624和rs1800625位点的基因型和等位基因分布情况AD组与对照组rs1800624和rs1800625位点基因型和等位基因频率分析结果显示：rs1800624位点的多态性差异具有统计学意义，AD组AA基因型频率(50%)和A等位基因频率(61.43%)分别明显高于对照组的(1.49%)和(13.43%)，与AD的发生相关；rs1800625位点的多态性差异无统计学意义，与AD的发生不存在相关性(见表3)。

表3rs1800624和rs1800625的基因型和等位基因分布情况

SNPID基因型/等位基因AD组对照组n(%)n(%)Chi-SquarePrs1800624AA35(50.00)1(1.49)44.53<0.0001AT16(22.86)16(23.88)TT19(27.14)50(74.63)A86(61.43)18(13.43)66.97<0.0001T54(38.57)116(86.57)rs1800625CC2(2.86)1(1.49)0.580.7482CT11(15.71)13(19.40)TT57(81.43)53(79.10)等位基因C15(10.71)15(11.19)0.020.8988T125(89.29)119(88.81)

2.4多因素logistic回归分析以是否患AD为因变量，年龄、性别和rs1800624和rs1800625的位点多态性(设置哑变量)为自变量进行logistic回归，变量选入和剔除水平均为0.05，结果显示最后纳入方程的因素只有rs1800624位点多态性，rs1800624位点AA基因型患AD的风险是AT基因型的34.994倍(OR=34.994，95%CI：4.264～287.179)；AA和AT基因型患AD的风险分别是TT基因型的92.089倍(OR=92.089，95%CI：11.777～720.070)和2.632倍(OR=2.632，95%CI：1.101～6.290)；A等位基因能够明显增加AD的发病风险(OR=7.895，95%CI：3.686～16.911)。

3讨论

随着全球人口老龄化，AD发病率和患病率呈逐年显著上升趋势，但其确切发病机制目前还尚未阐明，临床上亦无特效治疗方法，寻找特异敏感的生物学标志，运用多种手段防治AD，具有深远的意义[7]。一般认为AD是遗传因素和环境因素共同作用的结果，而遗传因素在AD的发病中起重要作用[8]。Alberti KG等人研究表明载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是AD的主要遗传风险因子[9]，但值得注意的是有50%散发AD患者并不携带ApoE，提示还存在其它遗传危险因子。

β-淀粉样蛋白形成淀粉样斑块和微管相关蛋白tau基因高度磷酸化后形成螺旋纤维丝是AD的主要病理学特征[10-11]。RAGE作为普遍存在于神经系统的膜受体，可以介导β-淀粉样蛋白透过血脑屏障，活化小胶质细胞，导致产生氧化应激、促进炎症病理反应并进一步反馈上调自身表达，所造成的神经损伤与AD发病直接相关[12]，可见，RAGE与AD的发生发展密切相关，但是目前从分子流行病学角度阐述RAGE基因与AD关系的研究较少。

人类RAGE基因位于6号染色体6p21.3，含有11个外显子和1个长约1.7kb的5′侧域，位于主要组织相容性复合物Ⅱ型分子与Ⅲ型分子的基因之间。Li K等人研究发现在中国汉族人群中RAGE基因rs2070600(G82S)位点多态性与AD的易感性有关，S等位基因可能是AD发生的危险因素，且在正常人群中，中国汉族人群的S等位基因频率高于高加索人、韩国人和日本人，表现出明显的种族差异[13]。Daborg J等人研究的结果显示在欧洲人群中RAGE基因rs2070600位点突变的S等位基因会增加AD的易感性[14]。Hudson BI等人研究发现位于RAGE基因启动子可调节区域中的rs1800624(-374T/A)和rs1800625(-429T/C)位点能显著增强RAGE基因的转录活性，且与2型糖尿病及其并发症相关联[15]。但是目前没有rs1800624和rs1800625位点多态性与AD发生关系的研究报道，故本研究探讨了其与AD发生的关联性。

本研究结果显示在中国汉族人群中，rs1800624位点在AD组中的基因型频率不符合HWE，突变的A等位基因型频率(61.43%)高于野生的T等位基因型频率，Salanti G等人研究认为病例组基因型频率因为功能上受到选择压力(疾病也算是一种选择压力)可能不符合HWE[16]；RAGE基因rs1800624位点多态性与AD的发生有密切的关联，A等位基因可能是AD发生的危险因素，这可能有助于评估个体的易感性，探索疾病预防控制的有效措施。

由于本研究只有137名研究对象，不能排除存在对结果的过高估计或者未能检测出较弱的相关性现象(如rs1800625位点的多态性是否与AD的发生相关)，在后续的研究中，需要进行大样本、多地区和多民族的研究，同时应纳入更多的有功能意义的多态性位点，开展更为全面深入地探讨。

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[收稿2016-03-02;修回2016-03-28]

(编辑：王福军)

Correlation study between gene polymorphism of RAGE and Alzheimer's disease in a Chinese Han population

HuangTong1,WenQi1,WangChangyi1,PengXiaolin1,ZhangChunhui1,LiuShengyuan1,LiKeshen2

(1.Nanshan Center for Chronic Disease Control of Shenzhen, Shenzhen Guangdong 518054, China;2.Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac and Cerebral Diseases,Zhanjiang Guangdong 524001,China)

[Abstract]Objective To examine the relationship between the receptor for advanced glycation end-products (RAGE) gene polymorphism and Alzheimer's disease in a Chinese Han population.Methods This is a case-control study. A total of 70 patients with Alzheimer's disease and 67 control subjects were included in this study. DNA was extracted directly from peripheral venous blood samples. PSTAR-II plus (IDN01-M-P2) detection technologies were used to identify single nucleotide polymorphism (SNP) distribution of RAGE gene loci. Genotype and allele frequency differences were analyzed and compared between the two groups.Results There was a significant difference in genotype frequency distribution of the rs1800624 loci. The patients with Alzheimer's disease had an obviously higher frequency of AA genotype (50%) and A allele (61.43%) than control subjects (1.49% and 13.43%). Alzheimer’s disease risk in rs1800624 AA genotype carriers was 34.994 times (OR=34.994, 95%CI:4.264～287.179) more than that in AT genotype carriers and AA/AT genotype carriers was 92.089 times (OR=92.089, 95%CI:11.777～720.070) and 2.632 times (OR=2.632, 95%CI:1.101～6.290) more than that in TT genotype carriers, respectively. A allele significantly increased the risk of Alzheimer's disease (OR=7.895，95%CI：3.686～16.911). However, no significant difference was found in genotype frequency distribution of the rs1800625.Conclusion RAGE gene in rs1800624 shows a strong relationship with Alzheimer’s disease. A allele could be a risk factor for Alzheimer's disease in Chinese Han population.

[Key words]Alzhemer's disease; receptor for advanced glycation end products; single nucleotide polymorphism

[中图法分类号]R592

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)02-0158-04

[通信作者]刘盛元，男，博士，副主任医师，研究方向：慢性非传染性疾病预防与控制，E-mail:liushenglb@126.com。

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：81302482)；广东省自然科学基金资助项目(NO：2015A030313767)；广东省医学科研基金资助项目(NO：A2015387)。