2型松弛素抗肺纤维化的研究进展

刘国清 王敏

摘 要：人类2型松弛素（Relaxin-2，RLN2）是一种作用广泛的小分子肽类激素，其抗纤维化作用近年来成为研究热点。除间质性肺疾病外，哮喘、COPD、矽肺等患者的呼吸道、肺泡周围甚至整个肺部在长期的损伤刺激下均会出现成纤维细胞分化、细胞外胶原沉积等纤维化病变。Relaxin-2可以通过激活1型松弛素受体（RXFP1）然后启动直接抗肺纤维化作用抑制成纤维细胞活动和细胞外胶原沉积等病变，也可以通过其他方式（如产生NO、激活糖皮质激素受体等）发挥间接抗肺纤维化作用。本文就松弛素在抗纤维化作用机制及其在抗肺纤维化疾病中的研究进展作一综述。

关键词：肺纤维化；2型松弛素

肺是发生纤维化病变的常见器官之一，由感染、机械通气、自身免疫等致肺损伤原因引起的肺部严重或长期的炎症刺激均可导致肺的纤维化变。肺损伤后损伤部位参与炎症反应的各种细胞分泌的趋化因子、转化生长因子（TGF）等细胞因子，趋化成纤维细胞浸润，其中转化生长因子β（TGF-β）可诱导成纤维细胞活化为肌成纤维样细胞、活化肺固有成纤维细胞，同时活化的平滑肌细胞和肌成纤维样细胞分泌细胞外基质。在这个过程中促纤维化因素和抗纤维化因素的调节的失衡就会导致平滑肌细胞过度增生、新生血管形成、细胞外基质大量沉积，最终导致肺纤维化的发生[1]。松弛素尤其是人2型松弛素被发现在抑制TGF-β、调控促纤维化和抗纤维化平衡方面具有显著作用[2]。松弛素是1926年发现的一种妊娠相关的肽类激素，除在妊娠和分娩过程中起重要作用外，其还具有舒张血管、血管再生、抗炎、抗纤维化、骨重建等作用[2]，在抗肺纤维化方面近年来也有了新的研究进展，本文就将其在细胞，动物、临床水平的抗肺纤维化研究进展作一综述。

1 人2型松弛素的一般特征

人2型松弛素（Relaxin-2，RLN2）是一种分子量约为6 kD的小分子肽类激素，由53个氨基酸缩合而成，结构类似于胰岛素，属于胰岛素超家族。人类共有7种编码松弛素家族多肽的基因，除灵长类外大多数动物只有6种编码松弛素家族肽的基因，编码人Relaxin-2的2型基因位于9号染色体，人类2型松弛素基因产物与啮齿类动物1型松弛素基因编码产物具有同源性，即人2型和啮齿动物1型松弛素都可以激活人或动物的1型松弛素受体。 RLN2的表达除产生于女性的卵巢、子宫和男性的睾丸、前列腺外，还主要以自分泌和旁分泌的形式广泛产生于肺脏、心脏、肾脏、脾、皮肤等器官[3]。具有抗纤维化作用的主要是人2型松弛素（啮齿类为1型松弛素），其主要与人1型松弛素受体（RXFP1）结合发挥生理作用。

2 人1型松弛素受体及其引发抗纤维化的下游细胞信号通路

包括人在内的哺乳动物具有4种松弛素家族肽受体，RLN2主要结合的受体是1型松弛素受体也是被配体激活后具有抗纤维化的主要松弛素家族肽受体。RXFP1广泛分布于生殖系统、脑、心脏、肺脏等器官。RXFP1在细胞外侧的复杂外功能区富含亮氨酸重复序列（LRR）而在细胞内侧结合有G蛋白藕联受体（GPCR），另外RXFP1受体中的低密度脂蛋白a（LDLa）组件、LRR和跨膜域的外侧袢2对于该受体与配体间的高亲和力结合以及信息的传递起至关重要的作用[4]。

RLN2与LRR区的结合改变了外侧区域的构象，进而促使LDLa组件与G蛋白偶联并可以通过四条途径以协同作用产生NO激活鸟苷酸环化酶使cGMP剧增，进而再通过增加表达金属蛋白酶（MMPs）和抑制Smad2磷酸化俩条路径发挥抗纤维化作用。其大致过程为松弛素作用于RXFP1后：途径一，RXFP1与Gαs耦合从而激活腺苷酸环化酶（AC），然后通过cAMP-蛋白激酶A（PKA）-IкB/NFкB途径上调诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）的表达；途径二，RXFP1同时耦合GαoB反向调节Gαs激活AC的过程；途径三，RXFP1耦合Gαi3和βγ亚单位从而激活磷脂酰肌醇激酶（PI3K）进而转录PKC-ζ、AKT、增加ERK的磷酸化，PKC-ζ再反过来激活AC5；途径四，PI3K转录的AKT、胞外信号相关激酶（ERK）分别上调eNOS和nNOS的表达。无论哪条途径最终都会通过增加NO的合成进行下一步的信号传递。松弛素这个的作用过程产生不同区域性cAMP影响不同的信号结局，并且在不同的器官会有不同的G蛋白被激活，在心脏成纤维细胞Gαs、GαoB、Gαi3三种G蛋白均可以与松弛素受体耦合而激活，但在肾脏肌成纤维样细胞只有Gαs、GαoB可以被激活Gαi3则不被激活，这种激活在肺部细胞的情况还未知[5]。在这个过程中金属蛋白酶1（MMP1）和NO合酶的表达增加最终通过核因子NFкB的增加转录来调节[3]。

RLN2可以降低金属蛋白酶组织抑制剂（TIPMs）在心脏、肝星状细胞、皮肤的表达，减除TIPMs对MMPs的抑制作用[6]，在肺中同样存在这种抗纤维化作用机制[7]。

信号小体是RLN2诱导产生的由Gαs、Gβγ以及AC2组成的蛋白复合体，AC2通过结合于RLN2C端螺旋结构的AKAP79与松弛素耦合。信号小体对秒摩尔浓度的松弛素非常敏感，这一特点是细胞对体液中极低浓度松弛素产生反应的基础，而可激活经典途径的高浓度松弛素是促使信号小体分解的因素。信号小体通过AKAP79将RXFP1和AC2架构在一起，使AC更容易被Gαs和Gβγ亚单位激活[5]。目前的研究显示同时有AC2和RXFP1表达的组织有脑、肺、心脏、子宫、骨骼肌，所以肺部组织可能也存在这种信号传导机制，这一机制为肺部微量吸入2型松弛素治疗肺纤维化的发生提供了思路。

3 人2型松弛素抗肺纤维化的作用机制

3.1 直接抑制成纤维细胞的活动 RLN2激活RXFP1后通过第2部分所述的细胞信号通路发挥抗纤维化作用。MMPs表达上调后细胞外基质降解增多，在肺组织主要是MMP1表达增多使1型和3型胶原降解增多，此外RXFP1被激活后大量产生的NO通过抑制Smad2的磷酸化抑制TGF-β1受体信号的向内传递进而抑制成纤维细胞的活化、增殖以及向肌成纤维样细胞的分化[8]。

纤维细胞、肌成纤维样细胞是一类具有收缩功能的细胞，这种功能使得成纤维母细胞具有迁徙到炎症部位的能力以及通过机械收缩向生化信号的转化机制保持肌成纤维样细胞的持续分化状态。RLN2可以通过iNOS依赖的NO/cGMP信号通路以及其下游的磷酸激酶G（PKG）的激活然后磷酸化RhoA，进而激活RhoA相关激酶（ROCK），最后ROCK引发MLC20去磷酸化导致肌成纤维样细胞的舒张，RLN2可以通过这种机制抑制成纤维细胞迁徙和肌成纤维样细胞分化的保持从而起到抗纤维化作用[9]。

3.2 抗炎和促进上皮细胞增殖作用 RLN2可以通过激活糖皮质激素受体、抑制炎症参与细胞的活动等抗炎作用起到预防肺纤维化发生的作用。糖皮质激素受体（GR）是一种配体依赖性转录因子的核受体，在早些年就被证实糖皮质激素可被松弛素激活[10]。被松弛素激活的GR可以产生刺激单核细胞分化为巨噬细胞减少细胞因子的释放（包括白介素1、6和肿瘤坏死因子）、改变多种影响结缔组织代谢的蛋白的表达、调节松弛素自身的表达量、上调GR表达量等作用[11]。RLN2也可以直接通过抑制炎症参与细胞的过度趋化和迁移调节炎症发生过程[12]。在炎症的前期阶段RLN2可阻止中性类细胞的活动[]，以及阻止嗜碱性类细胞和肥大细胞脱颗粒和释放组胺[13]，避免炎症造成的过度损伤。此外，RLN2可以促进气道上皮细胞的增殖和迁移[14]，从而加快气道正常损伤修复避免过度的纤维瘢痕形成。

4 RLN2在动物和临床抗纤维化方面的研究及展望

最早抗纤维化的临床应用研究是在抗硬化症方面[15]，随后在抗肺纤维化病变方面的研究逐渐增多，但几乎都处于动物实验阶段。遗憾的是在一项针对系统性硬化症的临床试验中松弛素组与安慰剂组的病人比较，肺纤维化和肺功能的改善并不明显[16]。不过在多种包括矽肺[10]、支气管哮喘、特发性肺纤维化[9]、肺移植后闭塞性细支气管炎[10]等动物肺纤维或气道纤维化疾病模型中，松弛素的治疗均可以表现出对纤维化明显的抑制和逆转作用。随着研究的深入，RLN2的一些不利因素逐渐浮出水面，在针对系统性硬化症3期临床试验中不少接受RLN2治疗的受试者在停药后出现了严重的肾损害和高血压症状[16]。最近的研究显示RLN2可以促进肿瘤细胞的生长和转移[]。此外，RLN2的促红细胞生成和促血管生成作用[17]也可能成为其治疗纤维化时的不利因素。近来有研究针对RLN2在合成及其副作用方面的不利因素，尝试合成新的RXFP1激动剂。CGEN25009是一种单链多肽，其前体蛋白是C1q肿瘤坏死因子相关蛋白8，报道称其可以低亲和力的结合并激活RXFP1，并且具有与RLN2相同的抗肺部炎症和抗肺部纤维化作用[11]。

虽然RLN2在抗肺纤维化的研究方面取得了不少进展，但是现有的研究几乎均集中在细胞和啮齿类动物，并且给药方式多为静脉或腹腔注射，而在大型动物模型上的复制还未见报道。对于肺部特有的吸入性给药方式也未见研究，在一项用鼻腔给与重组人2型松弛素抗小鼠气道重塑实验中，取得了较显著的抗纤维化效果[18]，吸入性给药是一种用药量少并且副作用小的肺部特有的一种局部给药方式，对于上文提到的CGEN25009这种新型的RXFP1激动剂，采用吸入给药方式或许会更为完善，而且RLN2诱导信号小体的对极微量的RLN2敏感的机制可能成为RLN2吸入治疗和降低副作用新思路。肺部损伤造成的肺纤维化病变或呼吸道重塑，现阶段尚无有效的治疗手段。RLN2在动物实验中显示出了较强的促沉积胶原降解、抑制成纤维细胞迁徙和分化、抑制肌成纤维样细胞分泌胶原等抗纤维化作用，但是RLN2除抗纤维化作用外仍表现出扩张那个血管、降低血浆渗透压、降血压、促红细胞生成等作用，这势必会阻碍松弛素在抗纤维化方面的应用。改变给药途径、将松弛素结构进行针对性的修饰、或者寻找选择性较强的RXFP1激动剂会成为松弛素抗纤维化的新的希望。

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作者简介：刘国清，研究生、医师，研究方向间质性肺疾病； 王敏，主任医师、教授、楚天学者，研究方向小儿呼吸系统疾病。